武艷，馮長江，恩和吉日嘎拉，黃沙，馬奎，楊思明，孫同柱，付小兵

瘢痕形成是組織損傷修復(fù)的正常過程，適度的瘢痕形成是一種生理性和自衛(wèi)性表現(xiàn)，而過度增生則屬于病理性改變。瘢痕可形成于機(jī)體的任何組織，臨床最常見的是皮膚組織。當(dāng)皮膚受到較重?fù)p傷后，無法達(dá)到完美修復(fù)，往往會(huì)形成難愈性瘢痕，對患者的生理和心理產(chǎn)生巨大影響。瘢痕形成的發(fā)生機(jī)制尚不明確，臨床治療一直難以取得突破。當(dāng)前干細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用已成為研究熱點(diǎn)，骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSCs)能夠促進(jìn)組織修復(fù)[1-2]，且在動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)其可減輕心[3]、肺[4]、肝[5]、腎[6]等多種器官的纖維化及腹膜纖維化[7]，有望在皮膚創(chuàng)面愈合過程中產(chǎn)生積極影響。因此，本研究采用同源BM-MSCs在不同時(shí)間點(diǎn)多次移植于博來霉素誘導(dǎo)的小鼠皮膚瘢痕模型[8]，以驗(yàn)證BMMSCs移植對皮膚瘢痕的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑 健康C57BL/6小鼠(模型建立及移植用：雌性，7～8周齡，體重23±3g；提取BM-MSCs用：雄性，3～4周齡，體重12±2g)由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，許可證編號SCXK京2009-0007。DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清及胰酶購自Gibco公司，BM-MSCs成骨、成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基所需成分磷酸甘油鈉、抗壞血酸磷酸鹽、地塞米松、胰島素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、吲哚美辛、L-脯氨酸、丙酮酸鈉購自Sigma公司，ITS-Premix購自BD公司，博來霉素購自日本化藥株式會(huì)社，轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)抗體及α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)購自Abcam公司，Cy3標(biāo)記的山羊抗兔IgG(H+L)及抗熒光猝滅封片劑購自碧云天公司，DAB顯色劑購自北京中杉金橋公司。CO2恒溫培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司，熒光倒置顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 BM-MSCs的分離及培養(yǎng) 將3～4周齡雄性C57BL/6小鼠頸椎脫臼處死，分離出股骨和脛骨，去除韌帶和多余組織，置于加雙抗的D-Hanks'液中；用注射器沖出骨髓細(xì)胞，70μm細(xì)胞濾網(wǎng)過濾，吹打制成單細(xì)胞懸液；將細(xì)胞接種在含10%FBS的DMEM/F12完全培養(yǎng)液(含100U/ml青霉素和100mg/ml鏈霉素)中，3d后更換培養(yǎng)液，去掉非貼壁細(xì)胞，此后每2d換液1次，待細(xì)胞生長融合達(dá)90%后消化傳代。實(shí)驗(yàn)采用第3～5代細(xì)胞。

1.3 BM-MSCs的成骨、成脂分化功能鑒定 選取生長狀態(tài)良好的第3代細(xì)胞分別加入成骨誘導(dǎo)體系[DMEM/F12(含10%胎牛血清)，10mmol/L β-磷酸甘油，50μmol/L抗壞血酸磷酸鹽，0.1μmol/L地塞米松]和成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)體系[DMEM/F12(含10%胎牛血清)，1μmol/L地塞米松，10μg/ml胰島素，0.5mmol/L IBMX，200μmol/L吲哚美辛]，每72h換液1次。成骨誘導(dǎo)時(shí)間為3周，成脂誘導(dǎo)時(shí)間為2周。通過茜素紅染色顯示鈣化結(jié)節(jié)沉積了解成骨情況，通過油紅O染色顯示脂肪空泡形成了解成脂情況。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥方式 將30只7～8周齡雌性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為對照組、皮膚瘢痕模型組及BM-MSCs移植組，每組10只。模型組和BMMSCs移植組小鼠經(jīng)背部皮下注射1ml濃度為1mg/ml的博來霉素(PBS溶解)，3h后BM-MSCs移植組經(jīng)皮下注射1×106個(gè)BM-MSCs，模型組給予相同劑量的PBS，對照組于相同時(shí)間點(diǎn)分別皮下注射相同劑量PBS。各組小鼠均連續(xù)注射28d，于第29天處死全部小鼠，取新鮮皮膚組織制備冰凍切片，另取皮膚組織經(jīng)4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，用于病理組織學(xué)觀察及免疫組織化學(xué)檢測。

1.5 TGF-β1表達(dá)水平的免疫熒光分析 新鮮皮膚組織經(jīng)OCT包埋，冰凍切片，厚6μm，100%甲醇固定10min，然后經(jīng)硼氫化鈉(1mg/ml，PBS溶解)孵育10min以降低自發(fā)熒光，0.5% Triton-X-100常溫孵育60min以透化固定后的細(xì)胞，進(jìn)口羊血清封閉液封閉30min，加入TGF-β1兔抗小鼠一抗稀釋液(1:500)4℃過夜，加入Cy3標(biāo)記的山羊抗兔IgG(H+L)室溫孵育2h，避光，抗熒光淬滅，封片劑封片，熒光倒置顯微鏡下觀察并照相。

1.6 病理組織學(xué)觀察 石蠟包埋皮膚組織常規(guī)切片，厚5μm，行HE及Masson's Trichome染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.7 α-SMA表達(dá)的免疫組織化學(xué)檢測 石蠟包埋皮膚組織標(biāo)本常規(guī)切片，厚5μm，脫蠟，3% H2O2室溫孵育5～10min滅活內(nèi)源性過氧化物酶，加入抗小鼠α-SMA單克隆抗體(1μg/ml)，4℃過夜，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察，并比較各組之間α-SMA的陽性表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK法(q檢驗(yàn))。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 BM-MSCs的分離培養(yǎng) 分離的BM-MSCs在接種24h后開始貼壁生長，3d后貼壁細(xì)胞明顯增多，并首次換液，去除未貼壁細(xì)胞，以后每隔2d換液，接種7d后細(xì)胞呈克隆樣生長，多呈紡錘形或梭形，接種后10～12d克隆之間逐漸融合，呈輻射狀或漩渦狀排列，并鋪滿整個(gè)培養(yǎng)瓶底部(圖1)。

圖1 倒置顯微鏡下觀察小鼠BM-MSCs形態(tài)(×100)Fig. 1 Morphology of mouse BM-MSCs under inverted microscope(×100)

2.2 小鼠 BM-MSCs 的成骨、成脂分化鑒定 選取生長狀態(tài)良好的第3代細(xì)胞，在成骨分化體系中誘導(dǎo)3周，茜素紅染色結(jié)果顯示有鈣化結(jié)節(jié)形成(圖2A)；在成脂分化體系中誘導(dǎo)2周，油紅O染色可見明顯的脂肪滴形成(圖2B)。

圖2 BM-MSCs成骨、成脂分化形態(tài)觀察Fig. 2 Morphology of BM-MSCs osteogenic (A) and lipoblast(B) differentiation

2.3 各組小鼠皮膚組織學(xué)檢測及真皮厚度比較HE及Masson's Trichome染色顯示：對照組皮膚組織結(jié)構(gòu)完整，呈紅染波紋狀，膠原纖維較細(xì)，密集排列，纖維間和纖維周圍可見部分成纖維細(xì)胞，無炎性細(xì)胞浸潤；模型組表皮層上皮增厚明顯，真皮層膠原沉積增加，膠原束增粗，排列不規(guī)則，脂肪層由結(jié)締組織取代，并可見大量炎性細(xì)胞浸潤；BM-MSCs移植組膠原排列與正常皮膚組織相似，部分脂肪層為結(jié)締組織取代，可見少量炎性細(xì)胞(圖3)。為評價(jià)各組纖維化的程度，對真皮厚度進(jìn)行測量，結(jié)果顯示模型組的真皮厚度(420.3±35.2μm)顯著高于BM-MSCs移植組(291.1±16.8μm，P＜0.05)及對照組(221.4±20.5μm，P＜0.01)，且BM-MSCs移植組的真皮厚度明顯高于對照組(P＜0.05)。

2.4 各組小鼠皮膚組織中TGF-β1的表達(dá) TGF-β1呈紅色熒光。免疫熒光檢測顯示對照組和BM-MSCs移植組中的TGF-β1表達(dá)較少，而模型組TGF-β1大量表達(dá)(圖4)。

圖3 小鼠皮膚組織學(xué)染色結(jié)果(×100)Fig. 3 Skin histology of C57BL/6 mice (×100)

圖4 皮膚組織中TGF-β1表達(dá)的免疫熒光檢測Fig. 4 Expression of TGF-β1 in skin tissue by immunofluorescene assay

2.5 各組小鼠皮膚組織中α-SMA蛋白的表達(dá) 免疫組織化學(xué)染色顯示，α-SMA陽性表達(dá)呈棕黃色顆粒狀，位于細(xì)胞質(zhì)中。對照組α-SMA蛋白幾乎全部表達(dá)于皮膚血管平滑肌細(xì)胞(19±3個(gè)/高倍視野)，而模型組除了血管平滑肌外，可見大量α-SMA表達(dá)于肌成纖維細(xì)胞(105±11個(gè)/高倍視野)，MSCs移植組表達(dá)α-SMA的肌成纖維細(xì)胞(46±7個(gè)/高倍視野)明顯少于模型組(圖5)。

圖5 皮膚組織中α-SMA蛋白表達(dá)的免疫組織化學(xué)檢測Fig. 5 Expression of α-SMA protein in skin tissue of mice by immunohistochemical test

3 討 論

皮膚受到較嚴(yán)重?fù)p傷后，往往會(huì)過度修復(fù)形成瘢痕，即細(xì)胞外基質(zhì)過度堆積，同時(shí)伴有膠原的合成與降解失衡。但由于皮膚瘢痕的形成機(jī)制復(fù)雜[9-10]，對其治療的研究尚處于探索之中。細(xì)胞移植治療具有來源廣泛、創(chuàng)傷小及可重復(fù)等優(yōu)點(diǎn)，成體干細(xì)胞及再生醫(yī)學(xué)相關(guān)技術(shù)的應(yīng)用為皮膚愈合中瘢痕抑制的研究提供了獲得重大突破的可能。BM-MSCs是干細(xì)胞家族的重要成員，具有自我更新和多向分化潛能。成年人骨髓中BM-MSCs含量很少[11]，但具有很強(qiáng)的體外擴(kuò)增能力，可動(dòng)員、歸巢并擴(kuò)充到損傷部位參與創(chuàng)傷修復(fù)，且可取自自體骨髓，取材方便，在移植時(shí)不存在組織配型及免疫排斥等問題[12]，因而可作為候選的種子細(xì)胞用于抑制瘢痕的形成。

既往研究發(fā)現(xiàn)，BM-MSCs作用時(shí)間較短，24h后即被清除[13-14]，因此在本實(shí)驗(yàn)中，我們采用經(jīng)局部皮下多次移植BM-MSCs的方法，病理及皮膚真皮厚度檢測結(jié)果證實(shí)，移植的BM-MSCs能有效抑制博來霉素誘導(dǎo)的小鼠皮膚瘢痕形成。TGF-β1是纖維化形成過程中的關(guān)鍵細(xì)胞因子，是迄今發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的可促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)沉積的蛋白，作用于瘢痕形成的多個(gè)環(huán)節(jié)，刺激各種細(xì)胞外基質(zhì)成分的合成及沉積，包括上調(diào)基質(zhì)成分的轉(zhuǎn)錄、翻譯，促進(jìn)基質(zhì)蛋白及受體產(chǎn)生，減少基質(zhì)降解酶以及降解抑制劑的合成等[15-16]。另外，在瘢痕的真皮中肌成纖維細(xì)胞增多，可促進(jìn)纖維化的病理過程[17]，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)(主要是膠原)的合成[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，BM-MSCs移植組中TGF-β1和α-SMA的表達(dá)均較模型組明顯減少，推測BM-MSCs可能與皮膚局部微環(huán)境互相作用，通過影響信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)抑制TGF-β1等致纖維化細(xì)胞因子的生成，降低膠原的合成，減少組織中膠原的沉積，從而起到抑制瘢痕形成的作用。

本研究結(jié)果表明，多次BM-MSCs移植能有效抑制博來霉素誘導(dǎo)的皮膚瘢痕形成，移植的BMMSCs可能與局部微環(huán)境相互作用，影響了TGF-β1等重要細(xì)胞因子的表達(dá)，抑制了肌成纖維細(xì)胞的增多，降低了膠原的合成，但其相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制仍需進(jìn)一步研究?？傊?，本研究為病理性瘢痕的治療提供了一種新的策略，也為干細(xì)胞用于臨床治療提供了新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1]Amado LC, Saliaris AP, Schuleri KH, et al. Cardiac repair with intramyocardial injection of allogeneic mesenchymal stem cells after myocardial infarction[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2005,102(32): 11474-11479.

[2]Uccelli A, Moretta L, Pistoia V. Mesenchymal stem cells in health and disease[J]. Nat Rev Immunol, 2008, 8: 726-736.

[3]Timmers L, Lim SK, Arslan F, et al. Reduction of myocardial infarct size by human mesenchymal stem cell conditioned medium[J]. Stem Cell Res Nov, 2007, 1(2):129-137.

[4]Kim SY, Lee JH, Kim HJ, et al. Mesenchymal stem cellconditioned media recovers lung fibroblasts from cigarette smoke-induced damage[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2012, 302(9): L891-L908.

[5]Abdel Aziz MT, Atta HM, Mahfouz S, et al. Therapeutic potential of bone marrow-derived mesenchymal stem cells on experimental liver fibrosis[J]. Clin Biochem, 2007, 40(12):893-899.

[6]Semedo P, Correa-Costa M, Cenedeze MA, et al. Mesenchymal stem cells attenuate renal fibrosis through immune modulation and remodeling properties in a rat remnant kidney model[J].Stem Cells, 2009, 27(12): 3063-3073.

[7]Wang N, Zhang L, Li QG, et al. Study on functional mode of marrow mesenchymal stem cells to acute peritoneal fibrosis[J].Med J Chin PLA, 2011, 36(12): 1263-1268.[王楠, 張利, 李清剛, 等. 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療急性腹膜纖維化的作用方式探討[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2011, 36(12): 1263-1268.]

[8]Yamamoto T, Kuroda M, Nishioka K. Animal model of sclerotic skin. III: Histopathological comparison of bleomycin-induced scleroderma in various mice strains[J]. Arch Dermatol Res,2000, 292(11): 535-541.

[9]Rhett JM, Ghatnekar GS, Palatinus JA, et al. Novel therapies for scar reduction and regenerative healing of skin wounds[J]. Cell,2008, 26(4): 173-180.

[10]Liu W, Wu XL, Gao Z. New potential antiscarring approaches[J].Wound Rep Reg, 2011, 19(Suppl 1): S22-S31.

[11]Parekkadan B, Milwid JM. Mesenchymal stem cells as therapeutics[J]. Annu Rev Biomed Eng, 2010, 12: 87-117.

[12]Chen L, Tredget EE, Liu C, et al. Analysis of allogenicity of mesenchymal stem cells in engraftment and wound healing in mice[J]. PloS one, 2009, 4(9): 1-7.

[13]Gao J, Dennis J, Muzic R, et al. The dynamic in vivo distribution of bone marrow-derived mesenchymal stem cells after infusion[J]. Cells Tissues Organs, 2001, 169(1): 12-20.

[14]Schrepfer S, Deuse T, Reichenspurner H, et al. Stem cell transplantation: the lung barrier[J]. Transplant Proc, 2007,39(2): 573-576.

[15]Krieglstein K, Miyazono K, Dijke P, et al. TGF-β in aging and disease[J]. Cell Tissue Res, 2012, 347(1): 5-9.

[16]Arany PR, Flanders KC, Kobayashi T, et al. Smad3 deficiency alters key structural elements of the extracellular matrix and mechanotransduction of wound closure[J]. PNAS, 2006,103(24): 9250-9255.

[17]Ludwicka A, Trojanowska M, Smith EA, et al. Growth and characterization of fibroblasts obtained from bronchoalveolar lavage of patients with scleroderma[J]. J Rheumatol, 1992,19(11): 1716-1723.

[18]Gabbiani G. The myofibroblast in wound healing and fibrocontractive diseases[J]. J Pathol, 2003, 200(4): 500-503.