浦江，崔立紅，劉超群，吳姍珊，李欣，李輝，羅哲

腹部開放傷海水浸泡是現(xiàn)代海戰(zhàn)中較為常見的傷型。海水具有高滲、高鈉、低溫的特點(diǎn)并含有多種細(xì)菌，海水進(jìn)入受傷腹腔后機(jī)體會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的應(yīng)激反應(yīng)，釋放大量炎癥介質(zhì)，胃黏膜上皮細(xì)胞出現(xiàn)壞死，凋亡增加，導(dǎo)致胃屏障功能障礙[1]。本研究以大鼠腹部開放傷合并海水浸泡為模型，觀察黃體酮對(duì)胃黏膜破壞、炎性反應(yīng)及細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑 雄性Wistar大鼠30只，清潔級(jí)，體重180～220g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。羊抗大鼠caspase-3多克隆抗體(一抗)由美國(guó)SantaCruz生物工程公司提供；TUNEL檢測(cè)試劑盒由德國(guó)Roche公司提供；鼠抗羊FITC-IgG二抗由北京中杉生物公司提供；黃體酮注射液購(gòu)自上海通用藥業(yè)股份有限公司。配方海水按國(guó)家海洋局第三研究所提供的人工海水配方配制。

1.2 動(dòng)物模型制備 實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物禁食12h，自由飲水，以鹽酸氯胺酮(10mg/kg)和速眠新(1ml/kg)配成麻醉劑，腹腔注射麻醉大鼠，取腹部正中縱行切口，長(zhǎng)2～3cm，將浸泡于0.19%氯化鈉溶液的塑料網(wǎng)片置入腹腔內(nèi)，以手術(shù)圓針帶線縫于腹壁上，防止浸泡過程中腸管擠出腹腔外。

1.3 動(dòng)物分組及給藥方法 將30只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物編號(hào)，利用隨機(jī)數(shù)字表法分成3組，每組10只。A組：腹部開放傷+滅菌注射用水皮下注射；B組：腹部開放傷海水浸泡+滅菌注射用水皮下注射；C組：腹部開放傷海水浸泡+黃體酮治療。A組大鼠開腹后敞開腹腔并浸入0.19%氯化鈉溶液中浸泡；B、C組大鼠于開腹后敞開腹腔并浸入海水中浸泡。浸泡后1、6、12h按16mg/kg劑量分別于皮下注射滅菌注射用水或黃體酮。16h后處死全部大鼠。

1.4 方法

1.4.1 胃黏膜損傷情況觀察 大鼠達(dá)到浸泡時(shí)限1h后迅速處死，標(biāo)本取出后立即沿胃大彎側(cè)剪開胃壁使黏膜面外翻，用冷生理鹽水沖洗黏膜面血跡，將黏膜面向上平展于紗布上，在10倍放大鏡下用游標(biāo)卡尺測(cè)量胃黏膜損傷情況。按Guth等[2]的標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分：點(diǎn)狀病變?yōu)?分；病變長(zhǎng)度＜1mm為2分；1～2mm為3分；2～4mm為4分；病變＞4mm為5分；病灶寬度＞1mm時(shí)分值×2。所有分值相加即為此只大鼠胃黏膜潰瘍指數(shù)(ulcer index，UI)。

1.4.2 光鏡下胃黏膜病理學(xué)觀察 于胃黏膜損傷最明顯處取胃組織0.5cm×1.0cm，置入4%甲醛中固定24h，常規(guī)石蠟包埋、切片、蘇木素-伊紅染色，行光鏡病理檢查。積分方法：對(duì)每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，每個(gè)視野按病變嚴(yán)重程度分級(jí)：0=正常，1=上皮細(xì)胞損傷和腺體破壞，2=黏膜的出血性損傷和不超過黏膜下層的壞死，3=超過黏膜下層的壞死和潰瘍。5個(gè)視野得分累計(jì)為其組織學(xué)損傷積分。

1.4.3 胃黏膜炎癥介質(zhì)水平測(cè)定 將剪為1～2cm長(zhǎng)短的胃體小彎用鹽水沖洗，濾紙拭干稱重，在冰水環(huán)境下用生理鹽水和勻漿器制作成2～3ml胃黏膜組織勻漿，在4℃低溫離心機(jī)離心15min后，收集上清液，按照試劑盒說明書應(yīng)用酶聯(lián)免疫法測(cè)定TNF-α、IL-6水平。

1.4.4 Caspase-3蛋白表達(dá)的免疫組化檢測(cè) 采用EnVision二步法，經(jīng)脫蠟，水化，3%H2O2處理去除內(nèi)源性過氧化物酶，枸櫞酸鹽溶液高壓修復(fù)抗原；滴加羊抗大鼠caspase-3多克隆抗體(1:100)，4℃過夜；滴加聚合物增強(qiáng)劑(試劑A)，37℃ 20min；滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鼠抗羊FITC-IgG二抗(試劑B)；DAB顯色；鏡下控制反應(yīng)時(shí)間不超過5min，雙蒸水終止反應(yīng)；蘇木素輕度復(fù)染，脫水、透明、封固、顯微鏡觀察。caspase-3蛋白表達(dá)量以其陽(yáng)性細(xì)胞在胃黏膜上皮細(xì)胞中的百分比表示。以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.4.5 TUNEL法檢測(cè)凋亡細(xì)胞 采用TUNEL法原位標(biāo)記DNA片段檢測(cè)凋亡細(xì)胞，全部程序按試劑盒提供的操作手冊(cè)進(jìn)行，DAB顯色。TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞為棕色。每片選5個(gè)高倍(×400)陽(yáng)性視野，根據(jù)多媒體病理圖像分析軟件(Olympus公司)計(jì)數(shù)每個(gè)視野中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用x±s表示，組間均數(shù)比較采用Chisequare檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 胃黏膜病理學(xué)變化 光鏡下病理學(xué)觀察顯示，海水浸泡腹部開放傷大鼠部分胃絨毛頂端脫落，血管擴(kuò)張、充血，小血管內(nèi)見較多嗜中性粒細(xì)胞聚集，隱窩細(xì)胞變性壞死，大多數(shù)胃黏膜病理?yè)p傷加重。應(yīng)用黃體酮后，從病理改變上看上述情況均明顯好轉(zhuǎn)，黏膜下層和肌層水腫、出血減輕，黏膜層有移行修復(fù)表現(xiàn)，但少數(shù)黏膜全層壞死者，黏膜層病變改善不明顯。

2.2 胃黏膜UI、組織學(xué)損傷積分及炎癥介質(zhì)水平測(cè)定 B組大鼠UI、黏膜組織學(xué)損傷積分與A組比較明顯增加(P＜0.01)，C組與B組比較則明顯降低(P＜0.05，表1)。B組大鼠胃黏膜組織勻漿TNF-α、IL-6濃度與A組比較均明顯升高(P＜0.01)，C組與B組比較則顯著下降(P＜0.05，表1)。

2.3 Caspase-3蛋白表達(dá)比較 Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞為棕黃色顆粒，表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)。正常大鼠胃黏膜組織中，可見胞質(zhì)內(nèi)棕黃色顆粒樣物質(zhì)呈散在分布。B組caspase-3蛋白表達(dá)(23.8%±3.5%)與A組(10.2%±1.6%)比較明顯增加(P＜0.01)；C組(17.1%±2.3%)與B組比較則明顯下降(P＜0.05)。

表1 胃黏膜潰瘍指數(shù)、組織學(xué)損傷積分及炎癥介質(zhì)水平比較(±s，n=10)Tab.1 Comparison of ulcer index, injury scales and inflammatory mediators of gastric mucosa s,n=10)

表1 胃黏膜潰瘍指數(shù)、組織學(xué)損傷積分及炎癥介質(zhì)水平比較(±s，n=10)Tab.1 Comparison of ulcer index, injury scales and inflammatory mediators of gastric mucosa s,n=10)

(1)P＜0.01 compared with A group; (2)P＜0.05 compared with B group

Group Ulcer index Injury scales TNF-α(μg/L) IL-6(ng/L)A 0.4±0.09 2.4±0.85 0.4±0.05 260±12.14 B 1.8±0.12(1) 5.0±0.78(1) 1.3±0.15(1) 620±18.36(1)C 1.4±0.15(2) 4.4±0.43(2) 1.1±0.09(2) 494±14.20(2)

2.4 凋亡細(xì)胞檢測(cè) 經(jīng)TUNEL染色，陽(yáng)性物質(zhì)呈棕黃色，主要位于細(xì)胞核內(nèi)，常聚集于核膜附近或核質(zhì)呈現(xiàn)均勻染色。B組凋亡細(xì)胞百分比(26.4%±2.8%)與A組(8.5%±1.5%)比較顯著增高(P＜0.01)，C組(19.8%±2.4%)與B組比較則明顯下降(P＜0.05)。

3 討 論

腹部開放傷海水浸泡后大鼠胃黏膜功能的主要變化包括應(yīng)激性潰瘍、胃動(dòng)力障礙、胃黏膜屏障破壞以及胃黏膜吸收功能的改變等四個(gè)方面[3]。外傷、休克均可導(dǎo)致胃黏膜炎性介質(zhì)過量生成，胃黏膜通透性增加。以往研究表明，腹部開放傷海水浸泡能夠?qū)е聶C(jī)體炎癥因子水平異常增高，胃黏膜形態(tài)破壞，胃黏膜上皮細(xì)胞過度凋亡等[1,3-4]。

研究表明，孕激素在改善心肌細(xì)胞損傷及凋亡、腸道黏膜組織損傷、大腦組織炎癥反應(yīng)及功能恢復(fù)等方面有一定作用[5]，且女性比男性對(duì)于機(jī)體損傷具有更好的耐受性，女性海戰(zhàn)傷傷員的全身臟器損傷程度比男性輕微[5]。皮質(zhì)類固醇能有效緩解潰瘍性結(jié)腸炎等炎癥性腸病的腸道黏膜損傷，但其導(dǎo)致的繼發(fā)細(xì)菌感染、骨質(zhì)疏松等不良反應(yīng)較為嚴(yán)重。與皮質(zhì)類固醇相比，黃體酮不良反應(yīng)較小。本研究觀察黃體酮對(duì)腹部開放傷海水浸泡大鼠胃黏膜上皮的形態(tài)、炎性介質(zhì)水平、上皮細(xì)胞凋亡等的影響。

腹部開放傷海水浸泡后胃黏膜上皮細(xì)胞顯著凋亡可能是導(dǎo)致胃黏膜損傷的原因之一[1-2]。相關(guān)研究顯示，腹部開放傷經(jīng)海水浸泡后，胃黏膜炎性介質(zhì)、黏附因子釋放增加，中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞在胃黏膜組織聚集等因素都加劇了胃黏膜的炎性反應(yīng)，造成胃黏膜結(jié)構(gòu)顯著損傷[5]。本研究表明，黃體酮能調(diào)節(jié)胃黏膜炎性細(xì)胞因子水平，降低海水浸泡后腹部開放傷大鼠胃黏膜組織的TNF-α和IL-6水平，降低潰瘍指數(shù)及組織損傷程度。

本研究還顯示，腹部開放傷經(jīng)海水浸泡后，大鼠胃黏膜上皮細(xì)胞大量凋亡，caspase-3表達(dá)明顯增加，表明腹部開放傷海水浸泡可以嚴(yán)重影響胃黏膜上皮細(xì)胞的凋亡狀況，打破胃黏膜上皮細(xì)胞正常的增殖與凋亡比例，破壞胃黏膜內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，影響胃黏膜的正常結(jié)構(gòu)從而導(dǎo)致功能障礙。經(jīng)黃體酮處理后，腹部開放傷海水浸泡大鼠TUNEL陽(yáng)性的凋亡細(xì)胞明顯減少，caspase-3表達(dá)下降，有利于胃黏膜上皮層結(jié)構(gòu)的維持及修復(fù)。

綜上所述，本研究表明黃體酮能抑制腹部開放傷海水浸泡大鼠胃黏膜的炎性反應(yīng)，保護(hù)其胃黏膜上皮的組織結(jié)構(gòu)，減少胃黏膜細(xì)胞的凋亡發(fā)生，減少應(yīng)激性潰瘍及上消化道出血的發(fā)生概率，為海水浸泡腹部開放傷傷員的早期救治提供了可能。

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