田河林，許忠新，韋立順，康艷輝，趙如同，金東嶺

糖尿病微血管病變是糖尿病的常見并發(fā)癥，而異常血管新生在糖尿病微血管病變的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[1]。微血管密度(microvessel density，MVD)是反映血管生成的生物指標，CD34在血管內(nèi)皮細胞呈強陽性表達，是目前檢測微血管的可靠標記[2]。非那雄胺是一種5α還原酶抑制劑，臨床用于良性前列腺增生癥(benign prostate hyperplasia，BPH)的治療。臨床研究發(fā)現(xiàn)，非那雄胺可減少前列腺經(jīng)尿道切除術(shù)患者的出血量，緩解BPH血尿癥狀，該作用可能與其抑制前列腺組織血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表達、降低MVD有關(guān)[3]。動物實驗結(jié)果顯示，非那雄胺可抑制早期糖尿病大鼠視網(wǎng)膜VEGF表達并降低MVD[4]。但有關(guān)非那雄胺對糖尿病腎臟MVD及VEGF表達的影響，國內(nèi)外尚未見報道。本研究采用鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導建立糖尿病小鼠模型，應用免疫組化方法觀察CD34及VEGF在糖尿病小鼠腎小球的表達，探討非那雄胺對糖尿病小鼠腎小球MVD的影響，旨在為研究非那雄胺對血管新生的作用及臨床應用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器 鏈脲佐菌素(Alexis公司)；非那雄胺(杭州默沙東制藥有限公司)；VEGF單抗、CD34單抗、SP檢測試劑盒及DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。血糖儀及血糖試紙購自艾康生物技術(shù)(杭州)有限公司。CX41型顯微鏡為日本Olympus公司產(chǎn)品。

1.2 實驗動物 清潔級昆明種小鼠35只，雄性，體重30～35g，由河北省實驗動物中心提供，許可證號SCXK(冀)2008-1-008。適應性飼養(yǎng)2周后開始實驗。動物禁食12h后，一次性腹腔注射1%鏈脲佐菌素溶液(pH4.4檸檬酸緩沖液配制)150mg/kg制備糖尿病模型。60h后，小鼠禁食(不禁水)12h，尾靜脈取血測空腹血糖，空腹血糖高于16.7mmol/L為造模成功[5]。將糖尿病模型小鼠按血糖值隨機分為4組，即模型組和非那雄胺0.1、1、10mg/kg組，每組7只；另取7只正常小鼠作為對照組。非那雄胺組小鼠每日分別給予非那雄胺0.1、1、10mg/kg灌胃，對照組和模型組小鼠給予等容量生理鹽水灌胃，連續(xù)4周。

1.3 標本處理 末次給藥后，小鼠禁食(不禁水)12h，稱空腹體重，測空腹血糖。腹腔注射烏拉坦1g/kg麻醉，摘取腎臟，以10%中性甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，連續(xù)4μm切片，行HE染色。CD34及VEGF染色采用免疫組化SP法，操作步驟按SP試劑盒說明書進行。用PBS代替一抗作陰性對照。

1.4 結(jié)果觀察 取HE染色切片進行腎臟形態(tài)學觀察，采用組織細胞病理分析軟件在400倍視野下測量腎小球面積(Ga)，根據(jù)文獻[6]方法計算腎小球體積(Gv)。Gv＝β/k×(Ga)3/2，其中β＝1.38(形態(tài)系數(shù))，k＝1.1(大小分布系數(shù))。每張切片隨機測定5個不重復腎小球，取其平均值。血管內(nèi)皮細胞胞質(zhì)呈棕黃色為CD34染色陽性，單個血管內(nèi)皮細胞或細胞簇染色陽性判定為一個微血管[3]。在400倍視野下每張切片隨機測5個不重復腎小球，取其平均值作為MVD值。細胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為VEGF表達陽性。按細胞染色強度(a)計分：淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；同時按顯色細胞百分比(b)計分：≤30%細胞顯色1分，31%～60%細胞顯色2分，≥61%細胞顯色3分。將2項得分的積作為VEGF表達指數(shù)(VEGF index)，即VEGF指數(shù)＝a×b[7]。在400倍視野下觀察，每張切片隨機取5個腎小球，取其平均值作為VEGF指數(shù)值。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 12.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)結(jié)果均以s表示，組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠體重及血糖水平比較 與治療前比較，4周后對照組小鼠活動正常，體重增加(P＜0.05)，空腹血糖值無顯著變化(P＞0.05)，模型組和非那雄胺各劑量組小鼠空腹血糖值明顯升高(P＜0.01)，體重有所下降，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。4周后，與對照組比較，模型組和非那雄胺各劑量組小鼠活動減少，體重顯著降低(P＜0.01)，空腹血糖值明顯升高(P＜0.01)，而與模型組比較，非那雄胺各劑量組小鼠體重和血糖值差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05，表1)。

2.2 各組腎小球組織形態(tài)學變化 腎臟病理檢查顯示，對照組小鼠腎小球、細胞外基質(zhì)及腎小管未見異常；模型組小鼠腎小球明顯增大，腎小球毛細血管數(shù)目增多，細胞外基質(zhì)增多，腎小管上皮細胞水腫，管腔擴張；非那雄胺0.1mg/kg和1mg/kg組小鼠腎臟形態(tài)學與模型組比較無明顯差異，非那雄胺10mg/kg組小鼠腎臟病變程度略輕于模型組(圖1)。組織細胞計量學測定結(jié)果顯示，模型組及非那雄胺各劑量組小鼠腎小球面積及體積均顯著大于對照組(P＜0.05，P＜0.01)；與模型組比較，非那雄胺0.1mg/kg和1mg/kg組腎小球面積及體積差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，但非那雄胺10mg/kg組小鼠腎小球面積及體積顯著減小(P＜0.01，P＜0.05，表2)。

表1 各組體重與血糖變化(s, n=7)Tab. 1 Changes of body weight and blood glucose level in different groups s, n=7)

表1 各組體重與血糖變化(s, n=7)Tab. 1 Changes of body weight and blood glucose level in different groups s, n=7)

(1)P＜0.01 compared with control group; (2)P＜0.05, (3)P＜0.01 compared with 0 week

Group Body weight(g) Blood glucose (mmol/L)0 week 4 week 0 week 4 week Control 37.2±2.7 41.5±2.9(2) 6.6±1.5 7.3±2.2 Diabetic model 36.7±2.6 35.0±2.7(1) 19.6±2.3(1) 27.5±2.5(1)(3)Finasteride 0.1mg/kg 35.9±2.3 34.5±2.7(1) 19.4±2.6(1) 25.6±2.6(1)(3)Finasteride 1.0mg/kg 37.0±2.6 35.2±3.0(1) 20.1±2.8(1) 26.4±2.3(1)(3)Finasteride 10mg/kg 36.5±2.7 34.2±2.6(1) 19.8±2.7(1) 26.7±2.4(1)(3)

圖1 腎小球組織形態(tài)學變化(HE ×400)Fig. 1 Histomorphologic changes of glomeruli in mice (HE ×400)

表2 各組腎小球面積和體積變化(s, n=7)Tab. 2 Changes of glomerular area and volume in glomeruli, n=7)

表2 各組腎小球面積和體積變化(s, n=7)Tab. 2 Changes of glomerular area and volume in glomeruli, n=7)

(1)P＜0.05, (2)P＜0.01 compared with control group; (3)P＜0.05,(4)P＜0.01 compared with diabetic model group

Glomerular volume(μm3, ×103)Control 2.0±0.6 116.6±52.8 Diabetic model 5.0±1.0(2) 455.9±137.2(2)Finasteride 0.1mg/kg 5.1±0.7(2) 457.1±89.3(2)Finasteride 1.0mg/kg 4.5±0.8(2) 397.7±91.0(2)Finasteride 10mg/kg 3.3±0.9(1)(4) 270.2±104.0(1)(3)Group Glomerular area(μm2, ×103)

2.3 各組腎小球MVD及VEGF表達 免疫組化染色顯示，與對照組比較，模型組及非那雄胺各劑量組小鼠腎小球CD34染色明顯增強；VEGF染色陽性細胞主要集中在腎小球，與對照組比較，模型組和非那雄胺各劑量組小鼠腎小球VEGF陽性表達明顯增強(圖2)。模型組和非那雄胺各劑量組小鼠腎小球MVD、VEGF指數(shù)均高于對照組(P＜0.05或P＜0.01)；與模型組比較，非那雄胺0.1mg/kg和1mg/kg組小鼠腎小球MVD、VEGF指數(shù)差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，非那雄胺10mg/kg組小鼠腎小球MVD、VEGF指數(shù)明顯降低(P＜0.05，表3)。

表3 腎小球MVD及VEGF表達變化(x±s, n=7)Tab. 3 Changes of MVD and VEGF expression in glomeruli n=7)

表3 腎小球MVD及VEGF表達變化(x±s, n=7)Tab. 3 Changes of MVD and VEGF expression in glomeruli n=7)

(1)P＜0.05, (2)P＜0.01 compared with control group; (3)P＜0.05 compared with diabetic model group

Group MVD VEGF index Control 14.5±2.7 2.3±1.3 Diabetic model 22.6±2.5(2) 6.6±1.6(2)Finasteride 0.1mg/kg 21.2±1.7(2) 6.1±1.1(2)Finasteride 1.0mg/kg 20.8±1.9(2) 5.8±1.2(2)Finasteride 10mg/kg 19.1±2.3(2)(3) 4.5±1.4(1)(3)

3 討 論

圖2 腎小球CD34及VEGF的表達(SP ×400)Fig. 2 Expression of CD34 and VEGF in glomeruli of mice (SP ×400)

目前認為，有多種因素參與了糖尿病微血管病變的發(fā)生發(fā)展過程，如生化代謝紊亂、血流動力學異常、細胞因子分泌增多等，但糖尿病微血管病變的發(fā)病機制尚不完全清楚。糖尿病動物模型的建立為研究糖尿病微血管病變發(fā)病機制及藥物療效評價提供了方便。鏈脲佐菌素對動物胰島β細胞具有選擇性殺傷作用，可特異性作用于胰島β細胞并破壞其結(jié)構(gòu)，導致胰島素分泌障礙，誘導糖尿病動物模型形成。本實驗采用一次性腹腔注射鏈脲佐菌素誘導建立糖尿病小鼠模型，成模后小鼠血糖升高，體重減輕，并伴有多食、多飲、多尿癥狀，病理學檢查發(fā)現(xiàn)成模小鼠出現(xiàn)了早期腎臟病變，包括腎小球肥大，細胞外基質(zhì)增多，腎小管上皮細胞水腫，管腔擴張等，與文獻[8]報道結(jié)果相符。

研究表明，異常血管新生與腎小球肥大、腎間質(zhì)損害及尿蛋白排泄增多有關(guān)，而抑制血管新生則可改善糖尿病腎臟病變[9-11]。本實驗免疫組化結(jié)果顯示，模型組小鼠腎小球CD34表達明顯增強，腎小球MVD顯著高于對照組；相似研究發(fā)現(xiàn)，鏈脲佐菌素誘導糖尿病小鼠3周時，其腎小球CD31(另一種血管內(nèi)皮細胞標記分子)陽性細胞數(shù)明顯增多[11]。上述結(jié)果表明，早期糖尿病小鼠腎小球已出現(xiàn)內(nèi)皮細胞增生、毛細血管數(shù)增多等變化，提示糖尿病早期腎小球已存在異常血管新生?，F(xiàn)有資料表明，異常血管新生是導致糖尿病腎臟病變的主要原因。高糖、缺氧、糖基化終末產(chǎn)物、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)等多種因素促進了腎臟VEGF的合成與分泌，VEGF表達上調(diào)最終導致內(nèi)皮細胞功能障礙和病理性血管新生[12]。

本實驗結(jié)果顯示，糖尿病小鼠給予非那雄胺10mg/kg連續(xù)灌胃4周，其腎小球MVD及VEGF指數(shù)明顯低于模型組，提示非那雄胺對糖尿病早期小鼠腎小球新生血管形成具有抑制作用。臨床資料顯示，非那雄胺可降低BPH患者前列腺尿道黏膜下MVD，且該作用與非那雄胺對此部位VEGF表達的抑制呈正相關(guān)[7,13]。動物實驗顯示，在四氧嘧啶誘導糖尿病大鼠模型中，非那雄胺與阿卡波糖聯(lián)合應用可顯著降低糖尿病大鼠視網(wǎng)膜MVD，并可抑制VEGF在視網(wǎng)膜的表達，而單用阿卡波糖則無此作用[4]?？梢姡悄切郯穼Σ煌M織新生血管形成具有抑制作用，該作用與其抑制VEGF在組織中的表達有關(guān)。血管新生是多種因素相互作用的結(jié)果，VEGF是其中的重要因素之一。但非那雄胺抑制血管新生的確切機制尚在進一步研究之中。

本實驗結(jié)果初步證實，非那雄胺可降低VEGF在糖尿病小鼠腎小球中的表達，降低腎小球MVD，抑制糖尿病所致腎小球新生血管形成，對糖尿病腎微血管病變具有潛在防治作用。

[1]Yu P, Li Q, Liu Y, et al. The changes of endothelial function of blood vessels in early diabetic nephropathy[J]. Chin J Pract Inter Med, 2010, 30(9):827-828. [于萍, 李強, 劉穎, 等. 2型糖尿病早期血管內(nèi)皮功能變化的研究[J]. 中國實用內(nèi)科雜志,2010, 30(9):827-828.]

[2]Acevedo LM, Londono I, Oubaha M, et al. Glomerular CD34 expression in short- and long-term diabetes[J]. J Histochem Cytochem, 2008, 56(6): 605-614.

[3]Memis A, Ozden C, Ozdal OL, et al. Effect of finasteride treatment on suburethral prostatic microvessel density in patients with hematuria related to benign prostate hyperplasia[J]. Urol Int, 2008, 80(2): 177-180.

[4]Dai XQ, Liu SS, Ni GB, et al. Effects of finasteride on expression of vascular endothelial growth factor and microvascular density in retina of early diabetic rats[J]. Chin J New Drugs Clin Rem,2004, 23(4): 199-202. [戴曉秦, 劉樹碩, 倪桂寶, 等. 非那雄胺對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮生長因子和微血管密度的干預[J]. 中國新藥與臨床雜志, 2004, 23(4): 199-202.]

[5]Bai H, Ma XY, Guo AT, et al. The study on complete Freud's adjuvant of prevention of STZ-induced diabetes[J]. Med J Chin PLA, 2008, 33(6): 712-714. [白樺, 馬學毅, 郭愛桃. 完全弗氏佐劑預防鏈尿菌素引起糖尿病的機制研究[J]. 解放軍醫(yī)學雜志, 2008, 33(6): 712-714.]

[6]De Vriese AS, Tilton RG, Elger M, et al. Antibodies against vascular endothelial growth factor improve early renal dysfunction in experimental diabetes[J]. J Am Soc Nephrol,2001, 12(5): 993-1000.

[7]Pareek G, Shevchuk M, Armenakas NA, et al. The effect of finasteride on the expression of vascular endothelial growth factor and microvessel density: a possible mechanism for decreased prostatic bleeding in treated patients[J]. J Urol, 2003,169(1): 20-23.

[8]Zhang HJ, Zhao JB, Li P. Progress in the study on animal model of diabetic nephropathy[J]. Chin Pharmacol Bull, 2008, 24(7):845-848. [張浩軍, 趙靜波, 李平. 糖尿病腎病動物模型研究進展[J]. 中國藥理學通報, 2008, 24(7): 845-848.]

[9]Osterby R, Bangstad HJ, Nyberg G, et al. On glomerular structural alterations in type 1 diabetes: companions of early diabetic glomerulopathy[J]. Virchows Arch, 2001, 438(2): 129-135.

[10]Ichinose K, Maeshima Y, Yamamoto Y, et al. Antiangiogenic endostatin peptide ameliorates renal alterations in the early stage of a type 1 diabetic nephropathy model[J]. Diabetes, 2005,54(10): 2891-2903.

[11]Yamamoto Y, Maeshima Y, Kitayama H, et al. Tumstatin peptide,an inhibitor of angiogenesis, prevents glomerular hypertrophy in the early stage of diabetic nephropathy[J]. Diabetes, 2004,53(7):1831-1840.

[12]Khamaisi M, Schrijvers BF, De Vriese AS, et al. The emerging role of VEGF in diabetic kidney disease[J]. Nephrol Dial Transplant, 2003, 18(8): 1427-1430.

[13]Lekas AG, Lazaris AC, Chrisofos M, et al. Finasteride effects on hypoxia and angiogenetic markers in benign prostatic hyperplasia[J]. Urology, 2006, 68(2): 436-441.