寧萌，潘亮，謝文利，金鑫

2型糖尿病(T2DM)占糖尿病患者的90%[1]，胰島功能衰退和胰島素抵抗(insulin resistance，IR)是其病理生理學(xué)基礎(chǔ)。目前，T2DM的治療主要是通過(guò)促進(jìn)β細(xì)胞分泌胰島素或改善靶組織對(duì)胰島素的敏感性進(jìn)行的，常用藥物包括胰島素及其類似物、磺酰脲類、雙胍類、噻唑烷二酮和抗糖尿病中藥類等。麥冬為一種常用滋陰中藥，藥理作用廣泛，臨床上用于糖尿病輔助治療效果顯著，還可降低糖尿病模型動(dòng)物的血糖[2]。但文獻(xiàn)報(bào)道多為復(fù)方制劑或粗提物，成分復(fù)雜，具體藥物成分不清且作用機(jī)制不詳。本研究選擇麥冬的主要成分麥冬多糖(ophiopogonpolysaccharide，OPSR)和麥冬皂苷(ophiopogonin，OPG)為研究對(duì)象，以3T3-L1誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞建立葡萄糖消耗模型，初步篩選出具有降糖和增加胰島素敏感性的提取物，觀察其對(duì)脂肪細(xì)胞瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素表達(dá)水平的影響，探討胰島素增敏相關(guān)機(jī)制，并應(yīng)用T2DM模型大鼠進(jìn)一步驗(yàn)證其治療效果。

1 材料與方法

1.1 主要材料 3T3-L1前脂肪細(xì)胞由同濟(jì)大學(xué)提供。雄性Wistar大鼠，190±10g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK-(軍)-2007-004。OPSR(平均分子量5600，純度90%)、OPG(純度90%)由本實(shí)驗(yàn)室提取。葡萄糖測(cè)定試劑盒購(gòu)自中生北控生物科技股份有限公司。鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)、胰島素(insulin，INS)、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX)為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。DMEM高糖培養(yǎng)基為美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品，瘦素抗體、脂聯(lián)素抗體、抵抗素抗體、β-actin抗體為美國(guó)Abcam公司產(chǎn)品。

1.2 3T3-L1脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化及鑒定 參照文獻(xiàn)[3]的方法進(jìn)行。3T3-L1前脂肪細(xì)胞用含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、0.1mg/ml鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)液在37℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞融合時(shí)，更換培養(yǎng)基為含有終濃度10μg/ml INS、1μmol/L地塞米松和0.5mmol/L IBMX的DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)48h，更換含10μg/ml INS的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48h，最后以DMEM完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)6d。3T3-Ll細(xì)胞誘導(dǎo)分化10d后，加入油紅O染液，30min后于顯微鏡下觀察。

1.3 葡萄糖消耗脂肪細(xì)胞模型的建立及麥冬提取物的篩選 將分化良好的脂肪細(xì)胞分為空白對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照INS組(10mg/L)，OPSR組(50、5、0.5mg/L)、OPG組(50、5、0.5mg/L)，OPSR(50、5、0.5mg/L)+INS組(10mg/L)，OPG(50、5、0.5mg/L)+INS組(10mg/L)，共13組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。按每孔200μl的量加入含提取物培養(yǎng)基，48h后，吸取細(xì)胞培養(yǎng)上清150μl，用葡萄糖檢測(cè)試劑盒測(cè)定培養(yǎng)液中葡萄糖的濃度，計(jì)算INS和樣品葡萄糖消耗率，用葡萄糖消耗比值計(jì)算樣品的降糖活性。葡萄糖消耗率(%)=(空白孔葡萄糖濃度－給藥孔葡萄糖濃度)/空白孔葡萄糖濃度×100%；葡萄糖消耗比值(%)=(樣品孔葡萄糖消耗率/INS孔葡萄糖消耗率)×100%。

1.4 Western blotting檢測(cè)OPSR對(duì)IR脂肪細(xì)胞瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素蛋白表達(dá)的影響 將分化好的3T3-L1脂肪細(xì)胞接種在培養(yǎng)瓶中，加入含1μmol/L地塞米松培養(yǎng)液，溫育48h后構(gòu)建脂肪細(xì)胞IR模型[4]。將細(xì)胞分為模型對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照羅格列酮(rosiglitazone，RTZ，1×10－6mol/L)組，OPSR低、中、高濃度(1×10－7、1×10－6、1×10－5mol/L)組。加入含OPSR培養(yǎng)液，孵育48h，然后加入INS，使其終濃度為100nmol/L，繼續(xù)孵育30min。提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法蛋白定量，SDSPAGE電泳，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、洗膜、封閉后，在封閉袋中分別加入瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素、β-actin一抗，4℃過(guò)夜，漂洗后加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育2h，漂洗后ECL發(fā)光、顯影、定影。以目的蛋白條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值作為指標(biāo)，再將此指標(biāo)與模型對(duì)照組作對(duì)比(Folds of control)，比較各組之間相對(duì)蛋白表達(dá)量的差異。

1.5 大鼠T2DM模型的建立及OPSR的治療作用檢測(cè) 參照文獻(xiàn)[5]方法建立大鼠T2DM模型。大鼠喂以高糖高脂飼料(飼料組成：10%豬油，20%蔗糖，2.5%膽固醇，1%膽酸鹽，66.5%常規(guī)飼料)，以誘導(dǎo)出IR。高糖高脂飲食1個(gè)月后，模型組腹腔注射25mg/kg STZ，對(duì)照組僅注射枸櫞酸緩沖液，STZ注射1周后，測(cè)定空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)和空腹胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INs)，計(jì)算胰島素抵抗穩(wěn)態(tài)評(píng)估模型(homeostasis model assessment of insulin resistance，HOMA-IR)，用以評(píng)價(jià)外周胰島素的抵抗程度。HOMA-IR=(FBG×FINs)/22.5[6]。將符合標(biāo)準(zhǔn)(FBG大于140mg/dl，胰島素敏感性降低)的大鼠確定為T2DM大鼠。將50只T2DM大鼠隨機(jī)分為模型組、RTZ(2mg/kg)組及OPSR高、中、低劑量(200、100、50mg/kg)組。另選擇10只正常大鼠為作正常對(duì)照組。給予OPSR和RTZ灌胃，1次/d，模型組和正常對(duì)照組給予生理鹽水，連續(xù)4周后，測(cè)定體重(body weight，BW)及外周血FBG、FINs、甘油三酯(triglyeride，TG)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以表示，多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3T3-Ll脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化及油紅O染色鑒定3T3-Ll前脂肪細(xì)胞在誘導(dǎo)分化前表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞樣，胞質(zhì)中無(wú)脂滴，誘導(dǎo)分化10d后，前脂肪細(xì)胞變圓、變亮，細(xì)胞質(zhì)中可見(jiàn)大量脂肪滴聚集，經(jīng)油紅O染色后呈鮮紅色，視野中90%以上3T3-Ll細(xì)胞呈這種脂肪細(xì)胞表型(圖1)。

2.2 葡萄糖消耗脂肪細(xì)胞模型篩選麥冬提取物結(jié)果 0.5、5、50mg/L OPSR可不同程度促進(jìn)脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗，呈劑量依賴性關(guān)系，葡萄糖消耗比值分別為32.27%、75.14%、90.47%，而OPG作用很弱，在50mg/L時(shí)葡萄糖消耗比值僅為8.49%。0.5、5、50mg/L OPSR+INS的葡萄糖消耗比值分別為127.37%、113.44%、101.61%，表明OPSR與INS聯(lián)合使用具有協(xié)同作用，能夠增加脂肪細(xì)胞對(duì)INS的敏感性，而OPG作用很弱(圖2)。

圖1 3T3-L1脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化及油紅O染色結(jié)果Fig.1 3T3-L1 cells and induced adipocytes stained by oil red O

圖2 OPSR和OPG作用于3T3-L1細(xì)胞后葡萄糖消耗比值Fig.2 Relative value of glucose uptake of 3T3-L1 adipocytes treated with OPSR and OPG

2.3 3T3-L1脂肪細(xì)胞瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素蛋白表達(dá)水平 各組瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素蛋白表達(dá)量與對(duì)照組的倍數(shù)比(Folds of control)分別為：STZ組1.12±0.06、1.11±0.02、0.88±0.04；OPSR低濃度組1.01±0.01、1.04±0.01、0.97±0.02；OPSR中濃度組1.04±0.01、1.08±0.02、0.93±0.02；OPSR高濃度組1.07±0.01、1.14±0.04、0.88±0.02。與對(duì)照組比較，其他各實(shí)驗(yàn)組瘦素、脂聯(lián)素蛋白表達(dá)量明顯提高且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，STZ組、OPSR中濃度組和OPSR高濃度組抵抗素蛋白表達(dá)量顯著降低(P＜0.05，圖3)。

2.4 OPSR對(duì)T2DM大鼠體重及血液生化指標(biāo)的影響 與正常大鼠比較，經(jīng)高糖高脂飲食結(jié)合小劑量STZ注射，模型組大鼠出現(xiàn)多食、多飲、多尿、體重減輕等糖尿病臨床表現(xiàn)，TG和FBG明顯升高(P＜0.01)，F(xiàn)INs沒(méi)有明顯改變，但HOMA-IR顯著升高(P＜0.01)，出現(xiàn)明顯IR。說(shuō)明T2DM病理模型建立成功。治療4周后，與模型組比較，OPSR高劑量組和RTZ組大鼠體重明顯增加，TG、FBG、HOMA-IR顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)，IR明顯改善(表1)。

圖3 各組3T3-L1脂肪細(xì)胞的瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素蛋白表達(dá)Fig.3 Expression of leptin, adiponectin and resistin protein of 3T3-L1 cells in different groups

表1 OPSR對(duì)T2DM大鼠BW、TG、FBG和FINs的影響(x±s, n=10)Tab.1 Effect of OPSR on BW, TG, FBG, FINs and HOMA-IR in T2DM rats n=10)

表1 OPSR對(duì)T2DM大鼠BW、TG、FBG和FINs的影響(x±s, n=10)Tab.1 Effect of OPSR on BW, TG, FBG, FINs and HOMA-IR in T2DM rats n=10)

(1)P＜0.01 compared with control group; (2)P＜0.05, (3)P＜0.01 compared with model group

Group BW(g) TG(mmol/L) FBG(mmol/L) FINs(mU/L) HOMA-IR Control group 325±52 0.97±0.15 5.93±1.04 17.8±2.3 4.67±0.11 Model group 286±34(1) 1.75±0.58(1) 13.93±1.98(1) 19.5±3.8 12.04±0.33(1)OPSR(200mg/kg) 314±31(3) 1.43±0.27(2) 6.43±1.39(3) 18.5±2.7 5.24±0.16(3)OPSR(100mg/kg) 309±47(2) 1.68±0.65 11.98±1.81(2) 20.8±4.7 11.07±0.38(2)OPSR(50mg/kg) 293±58 1.76±0.53 13.82±3.44 18.4±3.5 11.28±0.53 RTZ(2mg/kg) 321±39(3) 1.37±0.32(2) 5.81±1.08(3) 18.8±3.3 4.84±0.15(3)

3 討 論

IR是T2DM發(fā)病的始動(dòng)因素，是機(jī)體對(duì)于胰島素效應(yīng)性降低的一種狀態(tài)，表現(xiàn)為胰島素效應(yīng)器官(肝臟、骨骼肌和脂肪)對(duì)胰島素的敏感性降低，其中脂肪組織是IR的始發(fā)部位。研究改善IR的藥物對(duì)于治療T2DM具有重要意義。Hong等[7]研究顯示麥冬水提物能明顯促進(jìn)3T3-L1脂肪細(xì)胞基礎(chǔ)葡萄糖攝入和胰島素刺激下的葡萄糖攝入，表明麥冬水提物增加脂肪組織攝取葡萄糖的作用與其增加胰島素的敏感性有關(guān)。但麥冬水提物成分復(fù)雜，物質(zhì)基礎(chǔ)不清，具體何種成分在此過(guò)程中起主要作用需要進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)建立了3T3-L1誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗和IR模型，結(jié)合大鼠T2DM模型，從細(xì)胞、分子和動(dòng)物整體水平全面研究了麥冬主要有效成分OPSR、OPG在降糖和增加胰島素敏感性中的作用及其機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，OPSR可促進(jìn)3T3-L1誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞利用葡萄糖，增加胰島素的敏感性，而OPG作用不明顯，初步推測(cè)Hong等[7]研究中麥冬水提物促進(jìn)3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖攝入和增加胰島素敏感性的主要有效成分是OPSR。但是高昌琨等[8]報(bào)道OPG對(duì)四氧嘧啶、腎上腺素及葡萄糖所致的小鼠高血糖均有明顯降糖效果，說(shuō)明單純以脂肪細(xì)胞為研究對(duì)象還不能完全排除OPG的降糖作用，還需要進(jìn)一步探討其對(duì)胰島素效應(yīng)器官骨骼肌和肝臟的作用，并對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行重復(fù)研究。T2DM大鼠模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，OPSR能夠降低T2DM大鼠BW、FBG、TG、FINs和HOMA-IR，說(shuō)明OPSR可以通過(guò)改善IR治療T2DM及其引起的代謝綜合征。脂肪組織產(chǎn)生并釋放多種脂肪細(xì)胞因子，這些脂肪細(xì)胞因子分為兩大類：一類是具有減弱胰島素生理功能的細(xì)胞因子，如抵抗素、TNF-α等，它們可以誘發(fā)和增強(qiáng)IR，從而降低胰島素敏感性；另一類是具有增強(qiáng)胰島素生理功能的細(xì)胞因子，如脂聯(lián)素[9]等，它們可以改善IR，從而增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，OPSR能夠劑量依賴性地提高胰島素抵抗3T3-L1脂肪細(xì)胞瘦素、脂聯(lián)素蛋白表達(dá)量，而降低抵抗素蛋白表達(dá)量，說(shuō)明OPSR降糖作用與IR脂肪細(xì)胞分泌的脂肪因子有關(guān)，可以通過(guò)促進(jìn)脂肪細(xì)胞高表達(dá)瘦素、脂聯(lián)素以及抑制脂肪細(xì)胞表達(dá)抵抗素等脂肪因子而增強(qiáng)脂肪細(xì)胞胰島素敏感性，進(jìn)而促進(jìn)對(duì)葡萄糖的攝取和利用。

[1]Gong YP, Li CL. The application and special considerations of glucose-lowering medications in elderly patients with type 2 diabetes[J]. Chin J Pract Inter Med, 2011, 31(8): 581-583. [龔燕平, 李春霖. 老年2型糖尿病不同降糖藥物應(yīng)用及特點(diǎn)[J].中國(guó)實(shí)用內(nèi)科雜志, 2011, 31(8): 581-583.]

[2]Kako M, Miura T, Usami M, et al. Hypoglycemic effect of the rhizomes of ophiopogonis tuber in normal and diabetic mice[J].Biol Pharm Bull, 1995, 18(5): 785-787.

[3]Cho KW, Zhou Y, Sheng L, et al. Lipocalin-13 regulates glucose metabolism by both insulin-dependent and insulin-independent mechanisms[J]. Mol Cell Biol, 2011, 31(3): 450-457.

[4]Ng Y, Ramm G, James DE. Dissecting the mechanism of insulin resistance using a novel heterodimerization strategy to activate Akt[J]. J Biol Chem, 2010, 285(8): 5232-5239.

[5]Li JW, Guo ZX. Effects of telmisartan on the expression of NADPH oxidase subunits in the myocardium of type 2 diabetic rats[J]. Med J Chin PLA, 2011, 36(10):1037-1040. [李佳偉,郭志新. 替米沙坦對(duì)2型糖尿病大鼠心肌NADPH氧化酶亞單位表達(dá)的影響[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2011, 36(10): 1037-1040.]

[6]Musen G, Jacobson AM, Bolo NR, et al. Resting-state brain functional connectivity is altered in type 2 diabetes[J]. Diabetes,2012, 61(9): 2375-2379.

[7]Hong SJ, Fong JC, Hwang JH. Effects of crude drugs on glucose uptake in 3T3-L1 adipocytes[J]. Kaohsiung J Med Sci, 2000,16(9): 445-451.

[8]Gao CK, Gao J, Xu XX. Effect of tatal saponins of ophiopogon on experimental hyperglycemias mice[J]. Chin J Exper Trad Med Formu, 2007, 13(5): 33-34. [高昌琨, 高建, 徐先祥. 麥冬總皂苷對(duì)實(shí)驗(yàn)性高血糖小鼠的降糖作用[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2007, 13(5): 33-34.]

[9]Schipper HS, Rakhshandehroo M, de Graaf SF V, et al. Natural killer T cells in adipose tissue prevent insulin resistance[J]. J Clin Invest, 2012, 122(9): 3343-3354.