蔡金玲，杜麗，馬瓊，潘秀頡，楊曉云，肖鳳君，崔玉芳

放射損傷復(fù)合創(chuàng)傷即放創(chuàng)復(fù)合傷(combined wound and radiation，CWR)多見于手術(shù)聯(lián)合放射治療、核事故以及戰(zhàn)時核爆炸等情況，是難愈性創(chuàng)傷的代表性傷類。創(chuàng)面愈合延遲是此類創(chuàng)傷的顯著特點，但其難愈機制尚未完全闡明。創(chuàng)傷后機體會產(chǎn)生過多炎性因子，且Th1/Th2平衡向Th2偏移，進而出現(xiàn)過度炎性反應(yīng)和(或)免疫抑制狀態(tài)[1]。已知脾臟等免疫組織對電離輻射具有高度敏感性，受到急性輻射損傷后可引起免疫功能受抑，嚴(yán)重影響機體功能恢復(fù)[2]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Tregs)/輔助性T細(xì)胞17(T helper 17 cells，Th17)平衡與多種疾病(如移植免疫、腫瘤免疫及自身免疫性疾病等)的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3-5]，在維持機體免疫內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)方面起重要作用，是現(xiàn)代免疫學(xué)關(guān)注的重點之一，然而其在放創(chuàng)復(fù)合傷中的變化及與傷口愈合的關(guān)系目前尚未見報道。據(jù)此，本實驗觀察了創(chuàng)傷合并5Gy ?射線全身照射大鼠脾臟Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞的變化以及Treg/Th17平衡的改變，以期從免疫學(xué)角度探索放創(chuàng)復(fù)合傷的難愈機制并為該類傷病的防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗分組及動物模型制備 清潔級雌性成年Wistar大鼠65只，體重200±20g，購于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心。按體重隨機分為正常對照組(正常組，n=5)、單純創(chuàng)傷組(單傷組，n=30)和創(chuàng)傷+5Gy ?射線全身照射組(傷照組，n=30)。大鼠經(jīng)1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，備皮、局部消毒后，在背部胸段制備直徑1.5cm圓形傷口2個，傷口間隔1.5cm，與脊柱平行，對稱于兩側(cè)，深達皮下組織全層。

1.2 照射方式和劑量 傷照組大鼠在致傷后裝入特制的有機玻璃盒內(nèi)，采用軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院60Co ?射線源一次性全身照射5Gy，源靶距4m，吸收劑量率為160.02cGy/min，正常組和單傷組行假照射。傷照后大鼠單籠飼養(yǎng)于清潔級動物房。

1.3 檢測指標(biāo)及方法

1.3.1 傷口殘留面積百分比 將傷照后1、3、7、14、21、28d時間點描記的傷口圖像掃描輸入Quantimet 970型自動圖像分析儀(Cambridge公司，英國)進行面積分析[6]。以致傷時的傷口面積作為原面積，各時間點描記的傷口面積為傷口殘留面積，計算傷口殘留面積百分比(傷口殘留面積/原傷口面積×100%)。

1.3.2 外周血白細(xì)胞及淋巴細(xì)胞計數(shù) 傷照后1、3、7、14、21、28d每組各取5只大鼠，留取尾靜脈血，用日本F800型血細(xì)胞自動分析儀檢測外周血白細(xì)胞及淋巴細(xì)胞計數(shù)。

1.3.3 Treg細(xì)胞亞群分析 傷照后1、3、7、14、21、28d每組各取5只大鼠，取脾臟冰浴制成細(xì)胞懸液(2×106/L)，裂解紅細(xì)胞，洗滌后加入適量抗大鼠CD4 FITC和CD25 APC抗體(eBioscience公司)，4℃孵育30min；洗滌后每管加入1ml新鮮配制的固定液，4℃避光孵育30min；破膜后加入抗大鼠Foxp3 PE抗體(eBioscience公司)，4℃避光孵育30min；洗滌重懸后，采用流式細(xì)胞儀(BD Calibur，美國BD公司)檢測Treg細(xì)胞比例，結(jié)果采用FlowJo軟件進行分析。

1.3.4 Th17細(xì)胞亞群分析 傷照后1、3、7、14、21、28d每組各取5只大鼠，取脾臟冰浴制成細(xì)胞懸液，紅細(xì)胞裂解后用含10%胎牛血清的RPMI 1640調(diào)整細(xì)胞濃度至2×106/ml，然后接種于24孔板，每孔1ml，同時加入刺激劑和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運抑制劑復(fù)合物(2μl/孔)，置于37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)5h；PBS洗滌后加入適量抗大鼠CD4 FITC抗體(eBioscience公司)4℃孵育30min；固定、破膜后加入抗小鼠IL-17A PE抗體(eBioscience公司)，室溫避光孵育30min；洗滌重懸后，采用流式細(xì)胞儀(BD Calibur，美國BD公司)檢測Th17細(xì)胞比例，結(jié)果采用FlowJo軟件進行分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)結(jié)果以x±s表示，組間比較采用SPSS 13.0軟件進行方差分析，進一步兩兩比較方差齊時采用LSD-t檢驗，方差不齊采用Dunnett's T3法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 傷口殘留面積百分比 傷口殘留面積百分比與傷口愈合速度成反比，傷口殘留面積百分比越大，表明傷口愈合速度越慢。傷照后1～3d傷照組傷口殘留面積百分比與單傷組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而7～14d時明顯高于單傷組(P＜0.01)，21d時單傷組傷口已基本愈合，而傷照組延遲至28d時才基本愈合(表1)。

表1 傷照后不同時間大鼠傷口殘留面積百分比(%，，n=5)Tab. 1 Percentage of residual wound area of rats at different time points after exposure to combined wound and radiation(%, x±s, n=5)

表1 傷照后不同時間大鼠傷口殘留面積百分比(%，，n=5)Tab. 1 Percentage of residual wound area of rats at different time points after exposure to combined wound and radiation(%, x±s, n=5)

Group 1d 3d 7d 14d 21d 28d MW 86.5±5.874.9±6.3 26.5±4.4 2.0±0.4 0 0 RW 86.2±5.874.8±4.1 39.8±3.0(1)3.5±0.8(1)2.5±0.4 0 MW. Wound only group; RW. Wound plus 5Gy whole body γ-radiation group; (1)P＜0.01 compared with MW group

2.2 外周血白細(xì)胞及淋巴細(xì)胞的變化 單傷組大鼠外周血白細(xì)胞及淋巴細(xì)胞計數(shù)在傷照后1～7d明顯低于正常組，14～28d時與正常組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。傷照組大鼠白細(xì)胞及淋巴細(xì)胞計數(shù)在傷照后1～14d明顯低于正常組和單傷組，21～28d時白細(xì)胞計數(shù)仍明顯低于正常組和單傷組，而淋巴細(xì)胞計數(shù)與單傷組比較未見明顯差異，但仍明顯低于正常組(圖1)。

2.3 大鼠脾臟Treg細(xì)胞及Th17細(xì)胞的變化 傷照后各時間點單傷組大鼠脾臟Treg細(xì)胞及Th17細(xì)胞比例與正常組比較未見明顯差異。傷照組Treg細(xì)胞比例僅在照后3d和7d高于正常組和單傷組(P＜0.01)，而Th17細(xì)胞于傷照后1d即顯著增高(P＜0.01)，3d時升至最高，7～21d時仍顯著高于正常組和單傷組，至28d才恢復(fù)至正常組和單傷組水平(圖2)。

圖1 傷照后不同時間大鼠外周血白細(xì)胞(A)及淋巴細(xì)胞(B)計數(shù)比較Fig. 1 Changes of peripheral white blood cell (A) and lymphocyte (B) counts in rats after exposure to combined wound and radiation

2.4 大鼠脾臟Treg/Th17比值的變化 傷照后各時間點單傷組大鼠脾臟Treg/Th17比值與正常組比較未見明顯差異。傷照組大鼠Treg/Th17比值于傷照后1d即迅速降低(P＜0.01)，3d降至最低，直至21d時仍明顯低于正常組和單傷組，28d時恢復(fù)至正常水平(圖3)。

圖2 傷照后不同時間大鼠脾臟Treg細(xì)胞(A)和Th17細(xì)胞(B)比例的變化Fig. 2 Changes of splenic Treg (A) and Th17 (B) percentages in rats after exposure to combined wound and radiation

圖3 傷照后不同時間大鼠脾臟Treg/Th17 比值的變化Fig. 3 Changes of splenic Treg/Th17 ratio in rats after combined wound and radiation

3 討 論

創(chuàng)傷合并放射損傷后使創(chuàng)傷和放射損傷均加重，其創(chuàng)傷愈合過程也變得更為復(fù)雜。因此，放創(chuàng)復(fù)合傷不僅是創(chuàng)傷醫(yī)學(xué)和放射醫(yī)學(xué)重點關(guān)注的課題，也是臨床救治的難題。雖然目前關(guān)于難愈性創(chuàng)傷的機制已有大量報道，但從整體免疫調(diào)節(jié)方面進行研究的報道較少。據(jù)此，本實驗觀察了創(chuàng)傷大鼠合并5Gy ?射線全身照射后Treg/Th17平衡的變化特點，期望能從免疫學(xué)角度為放創(chuàng)復(fù)合傷深層次損傷機制的研究提供依據(jù)。

本研究對傷口殘留面積進行定量分析發(fā)現(xiàn)，5Gy全身照射后傷口愈合明顯延遲，與單傷組比較延遲約1周，而傷照組外周血白細(xì)胞計數(shù)也一直處于較低水平，與以往實驗結(jié)果一致[6]，表明本實驗建立的模型是成功的。Treg細(xì)胞是具有免疫抑制活性的T細(xì)胞亞群，其最主要的生物學(xué)功能是調(diào)節(jié)抗炎和致炎T細(xì)胞之間的平衡，它的免疫活性決定著炎癥的方向和轉(zhuǎn)歸。Ni Choileain等[7]研究顯示，燒傷后7d小鼠淋巴結(jié)中Treg細(xì)胞活性明顯增加；Huang等[8]研究發(fā)現(xiàn)，嚴(yán)重?zé)齻颊咄庵苎蠺reg細(xì)胞明顯增加，而且Treg細(xì)胞分泌的TGF-β和IL-10也顯著增多。提示燒傷誘發(fā)的Treg活性和功能增強，可能有助于拮抗創(chuàng)傷后過度炎癥反應(yīng)的發(fā)生。本課題組前期觀察到經(jīng)6Gy ?射線照射后，小鼠脾臟等免疫組織Treg細(xì)胞比例明顯增加[9-10]，外周血IL-10和TGF-β抑制性細(xì)胞因子含量明顯增高[10]。本實驗結(jié)果顯示，與正常組比較，單傷組脾臟中Treg細(xì)胞未見明顯變化，而傷照后3～7d，傷照組大鼠脾臟中Treg細(xì)胞則顯著高于正常組和單傷組。上述結(jié)果提示，輻射可導(dǎo)致Treg細(xì)胞比例增加，引起免疫調(diào)節(jié)異常，這可能是創(chuàng)傷愈合延遲的重要原因之一。

Th17細(xì)胞是近年發(fā)現(xiàn)的一種不同于Th1和Th2的CD4+效應(yīng)性T細(xì)胞，主要分泌IL-17、IL-22等促炎因子。Th17可通過直接和間接作用引起炎性細(xì)胞浸潤及組織損傷，因此在感染或損傷早期的炎癥反應(yīng)中具有至關(guān)重要的作用。Sasaki等[11]研究發(fā)現(xiàn)，燒傷后3h即可在小鼠燒傷皮膚組織中檢測到高水平的IL-17和IL-22，Neely等[12]也發(fā)現(xiàn)燒傷后小鼠創(chuàng)面引流淋巴結(jié)中Th17比例及數(shù)量均顯著增高，表明Th17參與了創(chuàng)傷局部早期的炎癥反應(yīng)。本實驗結(jié)果顯示，傷照組大鼠脾細(xì)胞中Th17顯著高于單傷組。由于Th17急劇升高，導(dǎo)致大鼠脾臟Treg/Th17比值在傷照后的1～21d持續(xù)降低，出現(xiàn)Treg/Th17平衡模式向Th17反應(yīng)漂移的現(xiàn)象。Treg與Th17在分化和功能上互相對抗，Treg/Th17平衡模式對維持機體免疫內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定具有至關(guān)重要的作用，一旦平衡失調(diào)，可引起全身或局部免疫應(yīng)答異常。

綜上所述，本研究結(jié)果提示創(chuàng)傷合并輻射損傷后Treg/Th17平衡模式向Th17免疫反應(yīng)漂移，致使機體持續(xù)處于以過度炎癥反應(yīng)為主的免疫紊亂狀態(tài)，進而影響局部創(chuàng)傷的修復(fù)，這很可能是輻射導(dǎo)致創(chuàng)傷難愈的深層次免疫學(xué)機制之一。

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