李 飛，朱永春，田 紅，高 鷹

（沈陽(yáng)師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，沈陽(yáng) 110034）

0 引 言

半胱氨酸（Cysteine）是一種含有巰基的氨基酸，在生命體中的酶催化、蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)等方面起著關(guān)鍵性作用。在臨床上，與同型半胱氨酸一樣，半胱氨酸的濃度失調(diào)將導(dǎo)致心腦血管等疾病，被作為疾病的生物標(biāo)記物。半胱氨酸通常的分析方法包括分光光度法、紙層析法、生物測(cè)定法、電化學(xué)檢測(cè)法、氨基酸分析儀和高效液相色譜法等［1］。其中電化學(xué)檢測(cè)方法的簡(jiǎn)單、快速、無(wú)毒、直接、成本低、靈敏度高和可用于活體檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)引起了廣泛的關(guān)注［2－5］。利用半胱氨酸分子中巰基—（SH）能夠與許多金屬有很強(qiáng)的相互作用的特點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)其在金屬電極上的固相微萃?。?－7］，實(shí)現(xiàn)萃取和富集與分析一體化，提高電分析方法的靈敏度和選擇性［8－9］。鉍電極具有與汞電極相似的性質(zhì)，常用于重金屬的分析測(cè)定，利用鉍與巰基的配位作用［10－11］。本文以碳纖維簇盤(pán)電極為基礎(chǔ)電極，電化學(xué)沉積鉍修飾電極，建立了半胱氨酸的固相微萃取和電化學(xué)檢測(cè)新方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器設(shè)備與試劑

儀器：CHI620b電化學(xué)分析儀（上海振華儀器公司），三電極體系（鉑絲為對(duì)極，飽和甘汞電極為參考電極，碳纖維簇電極為基礎(chǔ)工作電極。

試劑：分別用磷酸氫二鈉，氫氧化鈉，檸檬酸作為緩沖溶液，控制pH范圍在3.0～10.6之間。硝酸鉀配成0.5mol／L濃度的溶液，做為支持電解質(zhì)溶液。硝酸鉍配成1.0mmol／L濃度的溶液，做為電極的修飾溶液。半胱氨酸配成0.001mol／L的儲(chǔ)備溶液，作為半胱氨酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液，胱氨酸，白氨酸，牛血清白蛋分別配成0.001mol／L濃度的溶液，作為干擾實(shí)驗(yàn)的溶液。以上試劑均為分析純，均購(gòu)買(mǎi)與沈陽(yáng)國(guó)藥集團(tuán)。實(shí)驗(yàn)所用廢水取自沈陽(yáng)師范大學(xué)校園的湖中，湖水煮沸十分鐘殺滅微生物，在室溫條件下用10000RPM離心機(jī)離心獲得。

1.2 碳纖維電極的制備

將一簇直徑約7μm的碳纖維以環(huán)氧樹(shù)脂固化在內(nèi)徑約3mm玻璃管中，置于空氣中放置晾干，一端在1 000目的金相砂紙和硫酸紙打磨拋光作為基礎(chǔ)工作電極。

將基礎(chǔ)工作電極置于0.001mol／L的Bi（NO3）3溶液中，以循環(huán)伏安的法將鉍沉積到電極表面上，即獲得鉍修飾的碳纖微簇工作電極。

2 結(jié)果與討論

2.1 半胱氨酸在鉍修飾電極上的電化學(xué)行為

將鉍修飾電極分別置于含有1.0×10－7M半胱氨酸的pH＝4.0的0.25M的硝酸鉀電解質(zhì)溶液中，在0.040V／s的掃速下進(jìn)行循環(huán)伏安試驗(yàn)，獲得的循環(huán)伏安曲線如圖1所示。鉍修飾電極在電解質(zhì)溶液中，沒(méi)有氧化還原峰（曲線1），而在含有半胱氨酸的溶液中于0.414V處出現(xiàn)一個(gè)不可逆氧化峰。屬于半胱氨酸與鉍形成絡(luò)合物的氧化峰。

該峰隨掃速的關(guān)系呈非線性關(guān)系，回歸方程為

此結(jié)果表明，電極過(guò)程受到擴(kuò)散和表面雙重控制，即與表面上沉積的鉍有關(guān)，又與溶液中半胱氨酸向電極表面上擴(kuò)散有關(guān)。試驗(yàn)中選擇掃描速度為0.04V／s。

圖1 鉍電極在含有（2）和不含有半胱氨酸的支持電解質(zhì)溶液中循環(huán)伏安曲線

2.2 鉍沉積量的影響

試驗(yàn)中以循環(huán)伏安法沉積鉍，在給定鉍鹽濃度、掃速和電位范圍下，鉍的沉積量與掃描圈數(shù)呈正比。保持其他條件不變，改變掃描圈數(shù)，將獲得不同鉍沉積量的電極置于含有1.0×10－6mol／L半胱氨酸的電解質(zhì)溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安試驗(yàn)，以獲得的氧化峰電流對(duì)掃描圈數(shù)作圖，如圖2所示。

從圖2可知，當(dāng)掃描圈數(shù)為6圈時(shí)，L－半胱氨酸的氧化峰值最大，所以確定硝酸鉍的最佳沉積圈數(shù)為6圈。

圖2 氧化峰電流與循環(huán)伏安掃描圈數(shù)的關(guān)系

2.3 溶液pH的影響

半胱氨酸為三元弱酸，具有三級(jí)電離常數(shù)，其pKa分別為2.12，8.21，10.38［］。溶液pH 決定半胱氨酸分子的存在形式，是與鉍原子相互作用的重要因素之一。通過(guò)磷酸緩沖體系控制溶液pH值在3.0～10.6范圍內(nèi)，在含有濃度為10－6mol／L的半胱氨酸溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安試驗(yàn)，將獲得的氧化峰電流對(duì)溶液pH作圖，如圖3所示。

隨溶液pH值的增加，氧化峰電流曲線變化，且分別在pH＝4.0和pH＝9.0處出現(xiàn)2個(gè)較大的峰，表明在此pH下，半胱氨酸的存在形式更有利于在鉍電極表面上吸附富集，使得氧化峰電流出現(xiàn)極大值。考慮到在弱堿條件下，鉍離子趨于形成氫氧化物沉淀而不利于半胱氨酸的吸附。因此，實(shí)驗(yàn)中選擇pH＝4.0為最佳pH.

2.4 最佳靜止時(shí)間

靜止時(shí)間是指將鉍修飾電極置于半胱氨酸的溶液中進(jìn)行吸附富集，直到進(jìn)行循環(huán)伏安掃描之前的時(shí)間間隔。在保持其他條件不變下，改變不同的靜止時(shí)間進(jìn)行循環(huán)伏安實(shí)驗(yàn)，將半胱氨酸溶液的氧化峰電流值對(duì)放置時(shí)間作圖，靜止時(shí)間為2s時(shí)，峰電流最大，表明半胱氨酸與鉍電極表面作用較快，不需要等待時(shí)間即可完成吸附平衡。因此，實(shí)驗(yàn)上選擇2s為最佳靜止時(shí)間。

2.5 最佳放置時(shí)間

放置時(shí)間是指電極置于溶液中，施加初始電位所持續(xù)的時(shí)間。保持其他條件不變，在不同靜止時(shí)間下進(jìn)行循環(huán)伏安實(shí)驗(yàn)，將L－半胱氨酸的氧化峰電流值對(duì)放置時(shí)間作圖，如圖4所示。

半胱氨酸的氧化峰電流在放置時(shí)間為10s時(shí)最大，所以實(shí)驗(yàn)中選擇放置時(shí)間為10s。

圖3 氧化峰電流與溶液pH關(guān)系

2.6 半胱氨酸的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

在最佳條件下，對(duì)不同濃度的半胱氨酸溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安實(shí)驗(yàn)，將獲得的循環(huán)伏安曲線中半胱氨酸氧化峰電流對(duì)濃度的對(duì)數(shù)作圖，如圖5所示。

半胱氨酸的氧化峰電流隨濃度的增大呈現(xiàn)兩段線性關(guān)系。在較低的半胱氨酸濃度范圍內(nèi)（1.0×10－16～1.0×10－10mol／L），氧化峰電流隨濃度的增加而增大，表明半胱氨酸－鉍絡(luò)合物濃度隨半胱氨酸濃度增加而增加，線性回歸方程為

圖4 氧化峰電流與放置時(shí)間關(guān)系

在半胱氨酸濃度范圍為1.0×10－7～1.0×10－4mol／L范圍內(nèi)，氧化峰電流隨半胱氨酸濃度的增加而降低，表明半胱氨酸在鉍電極表面形成自組裝膜，而降低了半胱氨酸－鉍絡(luò)合物的氧化還原活性，導(dǎo)致電流下降。其回歸方程為

在最佳條件下，進(jìn)行了10次檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。平均氧化峰值電流為1.797 7±0.119 2μA，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.6%。

圖5 峰電流與濃度的對(duì)數(shù)關(guān)系

2.7 干擾實(shí)驗(yàn)

在相同優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，在含有1.0×10－13mol／L半胱氨酸溶液中加入等濃度的白氨酸、胱氨酸、蛋白質(zhì)，進(jìn)行的干擾實(shí)驗(yàn)。改變比率，發(fā)現(xiàn)100倍的3種物質(zhì)均不影響半胱氨酸的檢測(cè)如表1所示。

表1 不同摩爾比下的共存物質(zhì)下測(cè)定半胱氨酸的相對(duì)誤差 %

2.8 實(shí)際水樣的檢測(cè)

將沈陽(yáng)師范大學(xué)校園湖水煮沸約10min，以殺死微生物，在室溫和10000RPM離心機(jī)離心。取湖水樣品溶液5.0mL，5.0mL緩沖液（pH 值4.0），5.0mL 0.5M 硝酸鉀。進(jìn)行了10次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，平均電流2.683μA，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得湖水中的半胱氨酸濃度估計(jì)為6.22μm。

3 結(jié) 論

綜上所述，循環(huán)伏安法研究了鉍修飾碳纖維簇電極上半胱氨酸的吸附萃取和電化學(xué)行為，并應(yīng)用于半胱氨酸的檢測(cè)，獲得以下結(jié)論：

1）循環(huán)伏安法在碳纖維簇電極表面上沉積鉍粒子，實(shí)現(xiàn)了碳纖維電極的鉍修飾，為半胱氨酸的固相微萃取奠定基礎(chǔ)；

2）在最佳條件下，循環(huán)伏安法監(jiān)測(cè)了半胱氨酸的電化學(xué)行為及其固相微萃取的動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)過(guò)程，建立了半胱氨酸的電化學(xué)檢測(cè)方法；

3）半胱氨酸的固相微萃取電化學(xué)檢測(cè)具有較高的靈敏度和選擇性，共存的白氨酸，胱氨酸和蛋白質(zhì)不干擾檢測(cè)，用于污水中半胱氨酸的分析，結(jié)果令人滿意。

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