李 飛，朱永春，田 紅，高 鷹

（沈陽師范大學 化學與生命科學學院，沈陽 110034）

0 引 言

半胱氨酸（Cysteine）是一種含有巰基的氨基酸，在生命體中的酶催化、蛋白質高級結構等方面起著關鍵性作用。在臨床上，與同型半胱氨酸一樣，半胱氨酸的濃度失調將導致心腦血管等疾病，被作為疾病的生物標記物。半胱氨酸通常的分析方法包括分光光度法、紙層析法、生物測定法、電化學檢測法、氨基酸分析儀和高效液相色譜法等［1］。其中電化學檢測方法的簡單、快速、無毒、直接、成本低、靈敏度高和可用于活體檢測等優(yōu)勢引起了廣泛的關注［2－5］。利用半胱氨酸分子中巰基—（SH）能夠與許多金屬有很強的相互作用的特點，可以實現(xiàn)其在金屬電極上的固相微萃?。?－7］，實現(xiàn)萃取和富集與分析一體化，提高電分析方法的靈敏度和選擇性［8－9］。鉍電極具有與汞電極相似的性質，常用于重金屬的分析測定，利用鉍與巰基的配位作用［10－11］。本文以碳纖維簇盤電極為基礎電極，電化學沉積鉍修飾電極，建立了半胱氨酸的固相微萃取和電化學檢測新方法。

1 實驗部分

1.1 儀器設備與試劑

儀器：CHI620b電化學分析儀（上海振華儀器公司），三電極體系（鉑絲為對極，飽和甘汞電極為參考電極，碳纖維簇電極為基礎工作電極。

試劑：分別用磷酸氫二鈉，氫氧化鈉，檸檬酸作為緩沖溶液，控制pH范圍在3.0～10.6之間。硝酸鉀配成0.5mol／L濃度的溶液，做為支持電解質溶液。硝酸鉍配成1.0mmol／L濃度的溶液，做為電極的修飾溶液。半胱氨酸配成0.001mol／L的儲備溶液，作為半胱氨酸的標準溶液，胱氨酸，白氨酸，牛血清白蛋分別配成0.001mol／L濃度的溶液，作為干擾實驗的溶液。以上試劑均為分析純，均購買與沈陽國藥集團。實驗所用廢水取自沈陽師范大學校園的湖中，湖水煮沸十分鐘殺滅微生物，在室溫條件下用10000RPM離心機離心獲得。

1.2 碳纖維電極的制備

將一簇直徑約7μm的碳纖維以環(huán)氧樹脂固化在內徑約3mm玻璃管中，置于空氣中放置晾干，一端在1 000目的金相砂紙和硫酸紙打磨拋光作為基礎工作電極。

將基礎工作電極置于0.001mol／L的Bi（NO3）3溶液中，以循環(huán)伏安的法將鉍沉積到電極表面上，即獲得鉍修飾的碳纖微簇工作電極。

2 結果與討論

2.1 半胱氨酸在鉍修飾電極上的電化學行為

將鉍修飾電極分別置于含有1.0×10－7M半胱氨酸的pH＝4.0的0.25M的硝酸鉀電解質溶液中，在0.040V／s的掃速下進行循環(huán)伏安試驗，獲得的循環(huán)伏安曲線如圖1所示。鉍修飾電極在電解質溶液中，沒有氧化還原峰（曲線1），而在含有半胱氨酸的溶液中于0.414V處出現(xiàn)一個不可逆氧化峰。屬于半胱氨酸與鉍形成絡合物的氧化峰。

該峰隨掃速的關系呈非線性關系，回歸方程為

此結果表明，電極過程受到擴散和表面雙重控制，即與表面上沉積的鉍有關，又與溶液中半胱氨酸向電極表面上擴散有關。試驗中選擇掃描速度為0.04V／s。

圖1 鉍電極在含有（2）和不含有半胱氨酸的支持電解質溶液中循環(huán)伏安曲線

2.2 鉍沉積量的影響

試驗中以循環(huán)伏安法沉積鉍，在給定鉍鹽濃度、掃速和電位范圍下，鉍的沉積量與掃描圈數呈正比。保持其他條件不變，改變掃描圈數，將獲得不同鉍沉積量的電極置于含有1.0×10－6mol／L半胱氨酸的電解質溶液中進行循環(huán)伏安試驗，以獲得的氧化峰電流對掃描圈數作圖，如圖2所示。

從圖2可知，當掃描圈數為6圈時，L－半胱氨酸的氧化峰值最大，所以確定硝酸鉍的最佳沉積圈數為6圈。

圖2 氧化峰電流與循環(huán)伏安掃描圈數的關系

2.3 溶液pH的影響

半胱氨酸為三元弱酸，具有三級電離常數，其pKa分別為2.12，8.21，10.38［］。溶液pH 決定半胱氨酸分子的存在形式，是與鉍原子相互作用的重要因素之一。通過磷酸緩沖體系控制溶液pH值在3.0～10.6范圍內，在含有濃度為10－6mol／L的半胱氨酸溶液中進行循環(huán)伏安試驗，將獲得的氧化峰電流對溶液pH作圖，如圖3所示。

隨溶液pH值的增加，氧化峰電流曲線變化，且分別在pH＝4.0和pH＝9.0處出現(xiàn)2個較大的峰，表明在此pH下，半胱氨酸的存在形式更有利于在鉍電極表面上吸附富集，使得氧化峰電流出現(xiàn)極大值?？紤]到在弱堿條件下，鉍離子趨于形成氫氧化物沉淀而不利于半胱氨酸的吸附。因此，實驗中選擇pH＝4.0為最佳pH.

2.4 最佳靜止時間

靜止時間是指將鉍修飾電極置于半胱氨酸的溶液中進行吸附富集，直到進行循環(huán)伏安掃描之前的時間間隔。在保持其他條件不變下，改變不同的靜止時間進行循環(huán)伏安實驗，將半胱氨酸溶液的氧化峰電流值對放置時間作圖，靜止時間為2s時，峰電流最大，表明半胱氨酸與鉍電極表面作用較快，不需要等待時間即可完成吸附平衡。因此，實驗上選擇2s為最佳靜止時間。

2.5 最佳放置時間

放置時間是指電極置于溶液中，施加初始電位所持續(xù)的時間。保持其他條件不變，在不同靜止時間下進行循環(huán)伏安實驗，將L－半胱氨酸的氧化峰電流值對放置時間作圖，如圖4所示。

半胱氨酸的氧化峰電流在放置時間為10s時最大，所以實驗中選擇放置時間為10s。

圖3 氧化峰電流與溶液pH關系

2.6 半胱氨酸的標準工作曲線

在最佳條件下，對不同濃度的半胱氨酸溶液中進行循環(huán)伏安實驗，將獲得的循環(huán)伏安曲線中半胱氨酸氧化峰電流對濃度的對數作圖，如圖5所示。

半胱氨酸的氧化峰電流隨濃度的增大呈現(xiàn)兩段線性關系。在較低的半胱氨酸濃度范圍內（1.0×10－16～1.0×10－10mol／L），氧化峰電流隨濃度的增加而增大，表明半胱氨酸－鉍絡合物濃度隨半胱氨酸濃度增加而增加，線性回歸方程為

圖4 氧化峰電流與放置時間關系

在半胱氨酸濃度范圍為1.0×10－7～1.0×10－4mol／L范圍內，氧化峰電流隨半胱氨酸濃度的增加而降低，表明半胱氨酸在鉍電極表面形成自組裝膜，而降低了半胱氨酸－鉍絡合物的氧化還原活性，導致電流下降。其回歸方程為

在最佳條件下，進行了10次檢測實驗。平均氧化峰值電流為1.797 7±0.119 2μA，相對標準偏差為6.6%。

圖5 峰電流與濃度的對數關系

2.7 干擾實驗

在相同優(yōu)化實驗條件下，在含有1.0×10－13mol／L半胱氨酸溶液中加入等濃度的白氨酸、胱氨酸、蛋白質，進行的干擾實驗。改變比率，發(fā)現(xiàn)100倍的3種物質均不影響半胱氨酸的檢測如表1所示。

表1 不同摩爾比下的共存物質下測定半胱氨酸的相對誤差 %

2.8 實際水樣的檢測

將沈陽師范大學校園湖水煮沸約10min，以殺死微生物，在室溫和10000RPM離心機離心。取湖水樣品溶液5.0mL，5.0mL緩沖液（pH 值4.0），5.0mL 0.5M 硝酸鉀。進行了10次重復實驗，平均電流2.683μA，由標準曲線計算得湖水中的半胱氨酸濃度估計為6.22μm。

3 結 論

綜上所述，循環(huán)伏安法研究了鉍修飾碳纖維簇電極上半胱氨酸的吸附萃取和電化學行為，并應用于半胱氨酸的檢測，獲得以下結論：

1）循環(huán)伏安法在碳纖維簇電極表面上沉積鉍粒子，實現(xiàn)了碳纖維電極的鉍修飾，為半胱氨酸的固相微萃取奠定基礎；

2）在最佳條件下，循環(huán)伏安法監(jiān)測了半胱氨酸的電化學行為及其固相微萃取的動力學和熱力學過程，建立了半胱氨酸的電化學檢測方法；

3）半胱氨酸的固相微萃取電化學檢測具有較高的靈敏度和選擇性，共存的白氨酸，胱氨酸和蛋白質不干擾檢測，用于污水中半胱氨酸的分析，結果令人滿意。

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