★ 陳蘭英 劉輝 王昌芹 段萌 羅穎穎 劉榮華

(1.江西中醫(yī)學(xué)院 南昌 330004；2.中藥固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心 南昌 330004)

桂枝芍藥知母湯對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)大鼠急性足趾腫脹及炎癥介質(zhì)的影響*

★ 陳蘭英1，2**劉輝1王昌芹1段萌1羅穎穎1劉榮華2

(1.江西中醫(yī)學(xué)院 南昌 330004；2.中藥固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心 南昌 330004)

目的：建立角叉菜膠誘導(dǎo)的大鼠足趾腫脹模型，觀察桂枝芍藥知母湯對(duì)足趾腫脹的時(shí)序性影響及不同起效時(shí)間點(diǎn)炎癥介質(zhì)的影響。方法：在大鼠左后肢足趾皮下注射λ-角叉菜膠0.1 mL/只致炎，隨后于0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 h各測(cè)一次足趾容積，計(jì)算足趾腫脹度和腫脹抑制率，確定最佳起效時(shí)間范圍；同時(shí)研究桂枝芍藥知母湯在起效時(shí)間內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)炎癥介質(zhì)的影響。結(jié)果：桂枝芍藥知母湯高(20g/kg)、中劑量(10g/kg)在1、2、3h，而低劑量組(5g/kg)在3h都能明顯降低足趾腫脹度和提高腫脹抑制率；與模型組比較，桂枝芍藥知母湯組在1h時(shí)血清中COX-2，PGE2，TNF-a以及NO均明顯降低(P﹤0.05)，在3h 時(shí)血清中IL-1β(P﹤0.01)、MPO(P﹤0.05)、TNF-a(P﹤0.01)、PGE2(P﹤0.01)的分泌顯著降低。結(jié)論：桂枝芍藥知母湯抗角叉菜膠致急性炎癥作用的有效時(shí)間范圍是1-3h，在1h主要抑制花生四烯酸的COX-2途徑，減少了PGE2、NO和TNF-a的釋放，在3小時(shí)則主要抑制IL-1β、TNF-a、PGE2及MPO等炎癥介質(zhì)的釋放，體現(xiàn)了中藥復(fù)方桂枝芍藥知母湯抗炎作用的時(shí)序變化特點(diǎn)。

桂枝芍藥知母湯；足趾腫脹；炎癥介質(zhì)；不同時(shí)間點(diǎn)

桂枝芍藥知母湯載于張仲景所著《金匱要略》卷上，謂：“諸肢節(jié)疼痛，身體尪羸，腳腫如脫，頭眩短氣，溫溫欲吐者?！爆F(xiàn)代藥理研究亦表明其具有治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、手足浮腫，消炎止痛、調(diào)節(jié)免疫的作用[1]且臨床療效顯著[2]。本文以經(jīng)典的角叉菜膠誘導(dǎo)大鼠足趾腫脹為模型[3]研究不同時(shí)間點(diǎn)桂枝芍藥知母湯的抗炎作用及對(duì)炎癥介質(zhì)的影響，為本方的臨床應(yīng)用提供科學(xué)合理的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物 桂枝芍藥知母湯處方藥材飲片購(gòu)于江西中醫(yī)學(xué)院姚荷生研究室門(mén)診部，經(jīng)鑒定符合2010版《中華人民共和國(guó)藥典》一部相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)，將藥材加入適量的冷蒸餾水浸泡0.5h，然后用武火加熱，待沸騰后再用文火煎煮40min，重復(fù)3次，合并3次水煎液，過(guò)濾，濃縮儲(chǔ)藏備用；吲哚美辛(indomethacin)購(gòu)于廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠40只，體重(160±15)g，雄性，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)SCXK(湘)2009-0004。

1.3 試劑 λ-角叉菜膠(λ-carrageenan)購(gòu)于sigma公司，提前1d用生理鹽水配置為1%(w/v)的溶液；戊巴比妥鈉使用時(shí)配置為2%的生理鹽水溶液；大鼠髓過(guò)氧化物酶(MPO)、大鼠前列腺素E2(PGE2)、大鼠環(huán)氧化酶-2(COX-2)檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于上海西唐生物科技有限公司(進(jìn)口分裝)；大鼠白介素-1β(IL-1β)、大鼠腫瘤壞死因子a(TNF-a)ELISA試劑盒購(gòu)于上海依科賽生物制品有限公司；一氧化氮(NO)一步法測(cè)試盒購(gòu)于南京建成。

1.4 儀器 YLS-7B足趾測(cè)定儀(安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司)；Thermo Multiskan Mk3酶標(biāo)儀 (芬蘭)；t10/t18/t25 ika勻漿機(jī)(德國(guó))；Hettich Mikro 22R冷凍離心機(jī)(德國(guó))。

1.5 方法[3]將40只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3d后，按體重隨機(jī)區(qū)組分為5組，即模型組、陽(yáng)性給藥組、桂枝芍藥知母湯高劑量組、桂枝芍藥知母湯中劑量組、桂枝芍藥知母湯低劑量組。模型組灌胃給予相應(yīng)體積生理鹽水，陽(yáng)性組灌胃給予9mg/kg的吲哚美辛；高劑量組灌胃給予20g/kg的桂枝芍藥知母湯水煎液， 中劑量組灌胃給予10g/kg的桂枝芍藥知母湯水煎液，低劑量組灌胃給予5g/kg的桂枝芍藥知母湯水煎液。所有大鼠在左后肢踝關(guān)節(jié)周?chē)鲆粯?biāo)記,測(cè)量每只大鼠正常足趾容積(V0)。給藥0.5h后，立刻給每只大鼠腹腔注射 2%戊巴比妥鈉 2mL/kg進(jìn)行麻醉，麻醉后在大鼠左后肢足趾皮下注射λ-角叉菜膠(1%，W/V)0.1 mL/只致炎角交菜膠誘導(dǎo)足趾腫脹模型建立及。

1.5.1 腫脹程度測(cè)定及腫脹抑制率計(jì)算[4,5]致炎后，于 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10h各測(cè)一次足趾容積(Vt)，觀察不同時(shí)間腫脹度的變化(Vt-V0)，并按下面公式計(jì)算腫脹抑制率。

1.5.2 桂枝芍藥知母湯在檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)炎癥介質(zhì)的影響比較 根據(jù)大鼠時(shí)間-足趾腫脹程度測(cè)定結(jié)果，選取桂枝芍藥知母湯對(duì)足趾腫脹抑制率有顯著作用的時(shí)間點(diǎn)來(lái)檢測(cè)其對(duì)不同炎癥介質(zhì)變化的影響。各組在檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)取腫脹的后足趾進(jìn)行勻漿，3 000轉(zhuǎn)低溫離心，取上清于-80℃凍存?zhèn)溆谩榱吮ＷC組織勻漿內(nèi)含物活性，以上所有操作都在冰浴中完成，分別測(cè)定了腫瘤壞死因子-α(TNF-a)、白介素IL-1β(IL-1β)、一氧化氮(NO)、前列腺素E2(PGE2)、環(huán)氧化酶-2(COX-2)、髓過(guò)氧化物酶(MPO)。以上各指標(biāo)測(cè)定根據(jù)所購(gòu)買(mǎi)的試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

2.1 桂枝芍藥知母湯對(duì)大鼠足趾腫脹的影響 桂枝芍藥知母湯對(duì)大鼠足趾腫脹有明顯抑制作用，且高、中劑量在1、2、3h有明顯作用；低劑量組在3h具有顯著作用，4h后桂枝芍藥知母湯對(duì)足趾腫脹無(wú)明顯影響(詳見(jiàn)表1)。

表1 桂枝芍藥知母湯對(duì)角叉菜膠誘導(dǎo)的大鼠足腫脹度影響(抑制率%)±S，n=8)

2.2 桂枝芍藥知母湯在不同檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)炎癥介質(zhì)的影響比較 根據(jù)大鼠時(shí)間-足趾腫脹程度測(cè)定結(jié)果，選取桂枝芍藥知母湯對(duì)足趾腫脹抑制率有顯著作用的時(shí)間點(diǎn)(1h和3h)來(lái)檢測(cè)其對(duì)不同炎癥介質(zhì)變化的影響。結(jié)果顯示桂枝芍藥知母湯在不同檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)不同炎癥介質(zhì)含量影響不同。與模型組相比，在抗1h，給藥組大鼠血清中COX-2，PGE2，TNF-a以及NO均明顯降低(P﹤0.05)；而在3h 時(shí)，給藥組大鼠血清中IL-1β(P﹤0.01)、MPO(P﹤0.05)、TNF-a(P﹤0.01)、PGE2(P﹤0.01)的分泌顯著降低(詳見(jiàn)表2)。

表2 桂枝芍藥知母湯在不同檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)角叉菜膠所致足腫脹炎癥介質(zhì)變化的影響±S，n=8)

3 討論

當(dāng)機(jī)體組織受到化學(xué)、物理?yè)p傷、炎癥因子刺激時(shí)從兩方面產(chǎn)生致炎作用[6,7]：一方面激活細(xì)胞磷脂酶A2(phospholipase A2,PLA2)水解細(xì)胞膜磷脂，生成花生四烯酸(arachidonic acid,AA)誘導(dǎo)COX-2的產(chǎn)生，其主要作用是把花生四烯酸轉(zhuǎn)變?yōu)榍傲邢偎仡?lèi)物質(zhì)(Prostaglandins,PGs)，其中PGE能夠傳張小血管，增高微血管通透性促進(jìn)水腫發(fā)生，在較高濃度時(shí)顯示趨化效應(yīng)，吸引中性粒細(xì)胞轉(zhuǎn)移到損傷組織。另一方面[8]刺激白介素(interleukin-1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子a(TNF-a)等細(xì)胞因子的分泌，從而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)粘附分子，加速白細(xì)胞與之粘附，引起急性炎癥、發(fā)熱等癥狀。髓過(guò)氧化物酶[9](myeloperoxidase，MPO)又稱(chēng)為過(guò)氧化物酶，主要存在于中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的嗜苯胺藍(lán)顆粒中，MPO是中性粒細(xì)胞的功能標(biāo)志和激活標(biāo)志，其水平及活性變化代表著嗜中性多形核白細(xì)胞(PMN)的功能和活性狀態(tài)，反應(yīng)了炎癥的嚴(yán)重情況，MPO在局部組織內(nèi)越多則代表炎癥反應(yīng)越嚴(yán)重。

本實(shí)驗(yàn)研究表明桂枝芍藥知母湯對(duì)角交叉膠誘導(dǎo)的足趾腫脹有明顯抑制作用，該作用主要是在不同時(shí)間通過(guò)對(duì)不同炎癥介質(zhì)的影響而實(shí)現(xiàn)的，且在1-3h與模型組比較有明顯差異，其中有最大差異的時(shí)間點(diǎn)即1h時(shí)則抑制了主要的炎癥發(fā)展通路即花生四烯酸的環(huán)氧化酶途徑，減少COX-2的產(chǎn)生，進(jìn)而減少了前列腺素類(lèi)物質(zhì)等炎癥介質(zhì)的釋放，而在3h時(shí)則抑制IL-1β、TNF-a、PGE2及MPO等炎癥介質(zhì)的釋放。體現(xiàn)了中藥復(fù)方桂枝芍藥知母湯抗炎作用的時(shí)序變化特點(diǎn)，可能與桂枝芍藥知母湯不同有效成分在不同時(shí)間點(diǎn)發(fā)揮作用有關(guān)，桂枝芍藥知母湯有效成分在體內(nèi)的變化及對(duì)不同炎癥介質(zhì)的作用有待進(jìn)一步研究。

[1]余方流，董群．桂枝芍藥知母湯對(duì)免疫性關(guān)節(jié)炎治療作用的實(shí)驗(yàn)研究[J]．中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2008，14(8) ：41-44．

[2]余闃，卿茂盛，林遠(yuǎn)方，等．桂枝芍藥知母湯治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎臨床療效觀察[J]．中華臨床醫(yī)學(xué)研究雜志，2005，11(13) ：1 873．

[3]陳奇.中藥藥理研究方法學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社；2006，293-307．

[4]Maruyama H， Sakamoto T，Araki Y，et al．Anti-inflammatory effect of bee pollen ethanol extract from Cistussp. of Spanish on carrageenan-induced rat hind paw edema[J]．BMC Complementary and Alternative Medicine，2010，23：10-30．

[5]Fernandes JC，Spindola H，de Sousa V，et al．Anti-Inflammatory Activity of Chitooligosaccharides in Vivo[J]．Mar Drugs，2010，8(6) ：1 763-1 768．

[6]Yang G，Im HJ，Wang JH．Repetitive mechanical stretching modulates IL-1 β induced COX-2， MMP-1 expression，and PGE2production in human patellar tendon fibroblasts[J]．Gene,2005， 363 (19) ：166-172．

[7]Jain NK，Ishikawa TO，Spigelman I，etal．COX-2 expression and function in the hyperalgesic response to paw inflammation in mice[J]．Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids．2008，79(6) ：183-190．

[8]Kataoka T，Teraoka J，Sakoda A，etal．Protective effects of radon inhalation on carrageenan - induced in?ammatory paw edema in mice[J]．In?ammation，2012，35(2) ：713-722．

[9]Castardo JC，Prudente AS，F(xiàn)erreira J，etal．Anti-in?ammatory effects of hydroalcoholic extract and two bi?avonoids from Garcinia gardneriana leaves in mouse paw oedema[J]. Ethnopharmacology，2008，118(3) ：405-411．

EffectofGuizhiShaoyaoZhimuDecoctiononAcuteSwellinganditsInflammatoryMediatorsatDifferentTimePoints

CHENLan-ying1,2,LIUHui1，WANGChang-qin1,DUANMeng1,LUOYing-ying2，LIURong-hua1

1.JiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanchang330004,China;2.NationalPharmaceuticalEngineeringCenterforSolidPreparationinChineseHerbalMedicine,Nanchang330006,China

Objective: To study Guizhi Shaoyao Zhimu Decoction on anti-inflammatory effect and inflammatory mediators release by establishing acute inflammatory model induced by λ- carrageenan. Method: After injecting λ- carrageenan 0.1 ml into each rat left hind toe subcutaneously，toe volume was measured at 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10h，then toe swelling degree and change of inflammatory mediators were determined at different time points. Results: The high and medium dose Guizhi Shaoyao Zhimu Decoction could significantly reduce the swelling degree and improve the swelling inhibition rate at 1，2，3 hours，but the low dose medicine had obvious effect at 3 hour；Compared with the model group，serum COX-2, PGE2, TNF-a and NO on Guizhi Shaoyao Zhimu Decoction group were obviously decreased at 1hour(P<0.05)，while serum IL-1 (P<0.01), MPO (P< 0.05), TNF-a (P<0.01), PGE2(P<0.01) decreased at 3hour. Conclusion: The therapeutic time of Guizhi Shaoyao Zhimu Decoction is 1-3 hours on acute inflammation induced by carrageenan. At 1 hour，it might interfere with COX-2 pathway of arachidonic acid (AA) metabolism and reduced release of NO，TNF-a，PGE2，but at 3 hour it inhibited the release of inflammatory mediators IL-1 β, TNF-a, PGE2and MPO. The result reflects the time-effect relationship characteristics of Chinese Medicine Compound Guizhi Shaoyao Zhimu Decoction.

Guizhi Shaoyao Zhimu Decoction(桂枝芍藥知母湯); Toe Swelling ; Inflammatory Mediators ; Different Time Points

國(guó)家自然科學(xué)基金資助課題(項(xiàng)目編號(hào)：81060373)。

**通訊作者：陳蘭英，女，博士，教授，研究方向：中藥藥效評(píng)價(jià)及作用機(jī)制研究，E-mail:cly2513@163.com。

R 285.5

A

2013-07-06)