★ 丁曦 姚定國

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 杭州 310009)

黃芪多糖對2型糖尿病大鼠HPA軸及海馬糖皮質(zhì)激素受體水平的調(diào)節(jié)作用*

★ 丁曦 姚定國

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 杭州 310009)

目的：觀察黃芪多糖(APS)對2型糖尿病大鼠HPA軸及海馬組織中糖皮質(zhì)激素受體水平的調(diào)節(jié)作用。方法：30只SD大鼠隨機分為正常對照組、DM模型組、APS干預(yù)組組，采用小劑量鏈脲佐菌素加高脂飲食飼養(yǎng)的方法建立2型糖尿病肥胖大鼠模型。成模4周后，斷頭處死所有大鼠，檢測各組大鼠血CRH、ACTH、CorT的含量，以及海馬組織中糖皮質(zhì)激素受體(GR)mRNA的表達。結(jié)果：DM模型組血ACTH、CorT含量較正常組顯著升高，與模型組大鼠相比，APS干預(yù)組大鼠血ACTH、CorT含量顯著降低(P<0.05)；DM模型組海馬GRmRNA含量較正常組極顯著降低，與模型組大鼠相比，APS干預(yù)組大鼠海馬GR mRNA含量明顯上調(diào)(P<0.01)。結(jié)論：APS保護高糖環(huán)境下的海馬組織，改善HPA軸功能，對糖尿病以及合并癥起到治療作用。

黃芪多糖；2型糖尿??；HPA軸；海馬GR mRNA

2型糖尿病主要由胰島素抵抗，胰島β細胞損傷引起。既往研究也大都聚焦于此，對于升糖激素以及HPA軸的研究較少。新近研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病患者體內(nèi)存在慢性氧化應(yīng)激，這種慢性應(yīng)激可損傷海馬，引起海馬退行性變，海馬對HPA軸抑制功能減弱，血漿糖皮質(zhì)激素水平升高。本研究選用SD大鼠制作模擬2型糖尿病模型，采用黃芪多糖(Astragalus poly saccharides，APS)進行干預(yù)，觀察模擬2型糖尿病大鼠的海馬組織中糖皮質(zhì)激素受體(Glucocorticoid receptor，GR)mRNA水平，以及HPA軸(CRH、ACTH、CorT)的功能變化，探討神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)與2型糖尿病的聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 造模及成模標(biāo)準

選擇SD成年雄性健康大鼠(8周齡，約250g)30只，分正常對照組10只，造模組20只大鼠(APS干預(yù)組10只，以及DM對照組10只)。對照組大鼠，普通飼料喂養(yǎng)；造模組高脂高糖飼料喂養(yǎng)4周后，腹腔注射STZ 25mg/kg第1次，4周后腹腔注射STZ 40mg/kg第2次，自由攝食與飲水誘導(dǎo)胰島素抵抗。出現(xiàn)胰島素抵抗且空腹血糖≥13.8mmol/L者為成模標(biāo)準。

1.2 分組及處理

以水煮醇沉法提取黃芪多糖(APS)，由浙江省中醫(yī)院制劑中心制備。各組動物自確定造模成功后第2天開始灌胃，1次/d：APS干預(yù)組予以70%純度的APS水溶液，按1.0g/kg/d灌胃；正常對照組和DM對照組灌服等量生理鹽水。

1.3 主要檢測指標(biāo)

成模4周后，每組斷頭處死所有大鼠，檢測指標(biāo)，包括：各組大鼠血CRH、ACTH、CorT含量的測定，以及海馬糖皮質(zhì)激素受體(GR)mRNA表達的測定。

1.3.1 血CRH、ACTH、CorT含量的測定

CRH、ACTH采血管中預(yù)先加入0.3mmol/L己二胺四乙酸二鈉溶液(每毫升全血20μL)和抑肽酶(每毫升全血500U)，預(yù)冷準確采集全血4mL，輕緩混勻，迅速在低溫(4℃)下離心，取血漿低溫保存。CorT采血管中預(yù)先不加抗凝劑，預(yù)冷準確采集全血1mL，低溫(4℃)離心，取血清低溫保存。檢測步驟嚴格按照CRH、ACTH、CORT試劑盒說明書操作。

1.3.2 海馬GR mRNA表達的測定

各組大鼠斷頭取腦，分離腦組織各部，液氮速凍后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中，備逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)使用。TRIzol提取海馬總RNA，用分光光度計測定RNA濃度。

GR mRNA引物上游：5'-CCTCCCATTCTAACCATCCTCA-3'，下游：5'-GCCTCCCTCTGCTAACCTGTG-3'。內(nèi)參β-actin引物：上游5'-CGTTGACATCCGTAAAGACCTC-3'，下游5'-TAGGAGCCAGGGCAGTAATCT-3'。92℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，55℃退火45s，72℃延伸45s，72℃后延伸5min，擴增30循環(huán)。

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，EB顯色，DH-202型數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)成像，CMIAS 圖像分析系統(tǒng)計算積分吸光度值(A值)。GR mRNA水平以PCR產(chǎn)物的A值與β-actin PCR產(chǎn)物A值之比表示。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的血CRH、ACTH、CorT含量比較(見表1)

與正常對照組相比，DM模型組大鼠的血ACTH、CorT含量均顯著增高(P<0.05)；與DM模型組比較，APS干預(yù)組大鼠的2種激素含量均明顯降低(P<0.05)。

表1 各組大鼠血CRH、ACTH及CorT比較

2.2 各組大鼠海馬GR mRNA表達(見表2)

與正常對照組相比，DM模型組大鼠海馬GR mRNA含量極顯著增高(P<0.01)；與DM模型組比較，APS干預(yù)組大鼠海馬GR mRNA含量極明顯降低(P<0.01)。

表2 各組大鼠海馬GR mRNA表達比較

3 討論

糖尿病因其嚴重的慢性并發(fā)癥而成為全球面臨的日益嚴峻的問題。近年來，2型糖尿病與神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)的關(guān)系已引起重視。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，部分2型糖尿病患者下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)的基礎(chǔ)活性呈不同程度的增高狀態(tài)[1]，晝夜節(jié)律也發(fā)生紊亂，表現(xiàn)為ACTH、皮質(zhì)醇水平的增高，從而加重組織胰島素的抵抗。因此，如何抑制HPA軸的功能亢進，是研究糖尿病以及合并癥發(fā)病機制及治療的一條探索途徑。

HPA軸激活的中樞控制復(fù)雜，海馬作為負反饋調(diào)節(jié)的高位中樞，又是應(yīng)激反應(yīng)的敏感區(qū)，以糖皮質(zhì)激素(GC)為信息因子參與抑制性調(diào)節(jié)，糖皮質(zhì)激素受體(GR) mRNA水平的高低顯示海馬的功能狀態(tài)。持續(xù)性的高糖刺激，導(dǎo)致氧化應(yīng)激產(chǎn)物蓄積，表現(xiàn)為氧化物O2-·產(chǎn)量增加，抗氧化物SOD、GSH-PX等活性下降，引起海馬神經(jīng)元損傷和功能障礙。本課題證實，DM模型組大鼠海馬組織中的GR水平明顯降低[2]。海馬對于HPA軸的抑制功能減退，皮質(zhì)醇分泌亢進；過多的皮質(zhì)醇反過來直接損傷海馬，促進興奮性氨基酸釋放，造成海馬乃至全腦興奮性毒性，加重海馬損傷。

黃芪是常用的補氣藥，氣味溫甘，對于“久病傷氣”的患者，尤為適宜。長期的高糖刺激，產(chǎn)生胰島素抵抗，導(dǎo)致體內(nèi)葡萄糖攝取和利用障礙，患者常有疲勞感，符合中醫(yī)的“氣虛”證，因此黃芪也是常用的降糖中藥之一。黃芪多糖(APS)是黃芪中的主要生物活性成分之一，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、促進骨髓造血干細胞增殖、抗氧化應(yīng)激等藥理作用[3-5]。APS在治療糖尿病及其并發(fā)癥方面也有顯著療效，其具體的降糖機制一直是研究的熱點。本課題結(jié)果顯示，APS保護高糖環(huán)境下的海馬組織，改善HPA軸功能，降低患者體內(nèi)ACTH及CorT水平，從而對糖尿病以及合并癥起到治療作用。

[1]章汝霜.下丘腦-垂體-腎上腺軸與糖尿病[J].國際病理科學(xué)與臨床雜志，2006，25(6)：550-551.

[2]Chan O，Inouye K，Varanic M，et al.Hyperactivation of the hypothalamo-pituitary-adrenocortical axis in streptozotocin-diabetes is associated with reduced stress responsiveness and decreased pituitary and adrenal sensitivity[J].Endocrinology，2003，143：1 761-1 768.

[3]劉端勇，趙海梅，周楓，等.黃芪多糖調(diào)節(jié)小鼠小腸黏膜淋巴細胞因子的表達[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2009，14(9)：692.

[4]Wang T，Sun Y，Jin L，et al.Enhancement of non-specific immune response in sea cucumber by Astragalus membranaceus and its polysaccharides[J].Fish Shellfish Immunol，2010，27(6)：757.

[5]曾廣仙，劉俊英，熊金蓉，等.黃芪多糖調(diào)節(jié)創(chuàng)傷應(yīng)激小鼠免疫功能的研究[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2005，24(12)：942.

RegulatingEffectofAPSontheExpressionLevelsofHPAAxisandGRmRNAintheHippocampusofType2DiabeticRats

DINGXi，YAODing-guo

TheFirstAffiliatedHospitalofZhejiangChineseMedicineUniversity,Hangzhou310000,China

Objective：To observe the regulating effect of APS on the expression levels of HPA axis and GR mRNA in the hippocampus of type 2 diabetic rats. Methods: To establish type 2 diabetic rats in obsess by injecting of low-dose STZ and fedding with high glucose and high-fat diet，after that the rats were randomly divided into 3 groups：normal group，model group，APS treatment group. After given different treatments for 4 weeks the rats were executed to test the expression levels of CRH、ACTH、CorT in plasma of rats and GR mRNA in the hippocampus. Results: Compared with model groups，the expression levels of ACTH、CORT in plasma of APS treatment group are signifi cantly lower(P<0.05)；the expression levels of GR mRNA in the hippocampus of APS treatment group are upgrade(P<0.01). Conclusion: APS can protect hippocampus，improve the function of HPA axis，and delay the occurrence of Diabetes and its complications.

APS；Type 2 Diabetes Mellitus；HPA Axis；GR mRNA

浙江中醫(yī)藥大學(xué)校級科研項目(項目編號：2012ZY04)。

R 285.5

A

2013-05-28)