★ 曹娟 黃宇玫

(1.江西省兒童醫(yī)院 南昌 330006；2.南昌大學(xué)科學(xué)技術(shù)學(xué)院 南昌 330029)

當(dāng)歸補血湯治療癌性貧血的實驗研究

★ 曹娟1*黃宇玫2

(1.江西省兒童醫(yī)院 南昌 330006；2.南昌大學(xué)科學(xué)技術(shù)學(xué)院 南昌 330029)

目的：研究不同濃度當(dāng)歸補血湯對荷瘤小鼠補血作用。方法：建立生長良好的H22小鼠的腹水模型,將荷瘤小鼠隨機分為2組(模型組、當(dāng)歸補血湯組)，另外再選12只健康小鼠為空白對照組(正常組)。給予正常組和模型組小鼠每日灌胃生理鹽水,當(dāng)歸補血湯組給予當(dāng)歸補血湯灌胃(劑量為12g·kg·d-1)。分組后連續(xù)給藥10d，于末次給藥24h眼球采血后處死小鼠收集骨髓。結(jié)果：實驗數(shù)據(jù)表明，與正常組相比，模型組紅細(xì)胞數(shù)及血紅蛋白含量明顯減少，提示可能存在癌性貧血現(xiàn)象。當(dāng)歸補血湯組相比模型組其紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白有所上升，提示當(dāng)歸補血湯可能對抗癌性貧血。將各組骨髓細(xì)胞體外培養(yǎng)，當(dāng)歸補血湯組能減緩癌性貧血小鼠骨髓紅系祖細(xì)胞的凋亡速度。結(jié)論：當(dāng)歸補血湯對荷瘤小鼠有一定補血作用。

當(dāng)歸補血湯；荷瘤H22；抗腫瘤；貧血

貧血是各種惡性腫瘤常見的并發(fā)癥，其發(fā)生率及嚴(yán)重程度與腫瘤類型、病程、治療方案、藥物劑量，以及患者放療和治療期間是否發(fā)生感染等因素有關(guān)，臨床上癌性貧血發(fā)生率高達(dá)50%以上。貧血可影響腫瘤治療，降低患者的生存質(zhì)量(QQL)，甚至危及生命。目前，惡性腫瘤及其治療相關(guān)性貧血(簡稱癌性貧血)已開始受到臨床重視。[1]

當(dāng)歸補血湯出自金代李東垣所著《內(nèi)外傷辨惑論》，是補氣生血的代表方，該方“重用黃芪大補脾肺之氣，以裕生血之源；更用當(dāng)歸益血和營，以使陽生陰長，氣旺血生”。[2-4]本實驗建立了H22腹水瘤小鼠癌性貧血模型，探討當(dāng)歸補血湯是否能修復(fù)骨髓有核細(xì)胞造血功能，治療癌性貧血，以期為當(dāng)歸補血湯的臨床應(yīng)用提供更多實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 動物與瘤株

小白鼠，昆明種，體重18-22g，清潔級。均由南昌大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號SCXK-2005-0004。動物在實驗前適應(yīng)性馴養(yǎng)1周。飼料和墊料由南昌大學(xué)實驗動物中心提供。實驗期間自由采食飲水。腹水型H22瘤株由國家固體制劑重點實驗室提供。

1.2 試驗藥物

中藥材購自南昌開心人大藥房:黃芪，500g/袋，批號:20100507，產(chǎn)地:甘肅岷縣;當(dāng)歸，500g/袋，批:20090907，產(chǎn)地:甘肅岷縣。取黃芪125g，當(dāng)歸25g，加蒸餾水浸泡1h，然后加1 000mL和500mL蒸餾水煮沸2次，每次1h，合并水液，濃縮至水煎液濃度1.2g生藥/mL,高溫消毒后置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 儀器與試劑

血球分析儀Sysmex-2000iV(Sysmex Corporation，日本);血球計數(shù)板(上海市求精生化試劑儀器有限公司)，酶標(biāo)儀，倒置顯微鏡，二氧化碳培養(yǎng)箱，超凈工作臺，DMSO(Am resco公司產(chǎn)品),四氮甲唑藍(lán)(MTT, Am resco公司產(chǎn)品),RPM I-1640完全培養(yǎng)基(Am resco公司產(chǎn)品)。

2 方法

2.1 動物模型的建立

無菌條件下抽取6-7d生長良好的H22小鼠的腹水,按1∶3比例用生理鹽水稀釋,反復(fù)沖打,充分混勻,在顯微鏡下計數(shù),用生理鹽水調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/mL,取0.2mL接種于每只小鼠腹腔，共24只。

2.2 分組及給藥

腫瘤接種24h后隨機分為兩組,荷瘤H22小鼠12只(模型組),當(dāng)歸補血湯組12只(中藥組);另外未造模的12只健康小鼠為空白對照組(空白組)。給予空白組和模型組小鼠每日灌胃生理℃鹽水0.1mL/10g,中藥組給予當(dāng)歸補血湯灌胃0.1mL/10g(劑量為12g·kg·d-1)。分組后第2d開始給藥，1次/d，連續(xù)10d，于末次給藥24h眼球采血后處死小鼠收集骨髓。

2.3 外周血RBC計數(shù)及血紅蛋白HB含量測定[5]

于第1、5、10d將各組小鼠眼球采血0.5mL，血樣置抗凝管，檢測外周血象。(1)紅細(xì)胞計數(shù)：取血20μL，加入3.98mL0.85%Nacl，混勻，用血細(xì)胞計數(shù)板于顯微鏡下計數(shù)紅細(xì)胞數(shù)量。(2)血紅蛋白含量的測定：取新鮮全血20μL，加入文齊氏工作液5mL，混勻，靜置5min后比色。以蒸餾水校正“0”點，讀取540mm吸光度(A)值，計算標(biāo)本中血紅蛋白的含量。

血紅蛋白(g/L)=吸光度×367.7

2.4 當(dāng)歸補血湯對小鼠骨髓有核細(xì)胞生長的影響

頸椎脫臼法處死小鼠，每組取5只小鼠取雙側(cè)股骨，6號針頭以1mL生理鹽水液沖出骨髓細(xì)胞，4號針頭過濾制成單個骨髓細(xì)胞懸液。收集細(xì)胞液至離心管中，1 000r/min，離心5min。棄上清。加入紅細(xì)胞裂解液(約3mL)，混勻。室溫靜置5min，再1 000r/min，離心5min，棄上清，PBS洗滌一遍，9mL 1640完全培養(yǎng)基重懸，每孔1mL，接種于12孔板中。鋪3塊板，分別為0、24、48h。每塊板均培養(yǎng)時間結(jié)束后每孔加入100μL MTT，繼續(xù)孵育4h。4h后，2 000r/min，離心10min。棄上清，每孔加入750μL DMSO，混勻后，轉(zhuǎn)移至96孔板中，490nm測其OD值。(12孔板，每孔設(shè)3個復(fù)孔，每個復(fù)孔200μL)。

2.5 統(tǒng)計學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 對肝癌H22腹水型小鼠生活狀況的影響

從腫瘤接種第4-5d開始，小鼠腹腔內(nèi)腹水開始形成，腹部開始膨隆增大(如圖1)。隨著腫瘤的生長，小鼠自主活動較少，進(jìn)食量和進(jìn)水量減少，反應(yīng)遲鈍，毛色暗淡無光澤。模型組小鼠的腫瘤腹水生長最快，以上反應(yīng)最明顯，其它組小鼠腹水的生長不及模型組。

圖1 左圖小鼠毛色暗淡，右圖小鼠腹部開始形成腹水

3.2 RBC計數(shù)及血紅蛋白HB

3.2.1 當(dāng)歸補血湯對腹水型小鼠紅細(xì)胞數(shù)的影響

實驗數(shù)據(jù)表明，與正常組相比，模型組紅細(xì)胞數(shù)明顯減少，提示可能存在癌性貧血現(xiàn)象。當(dāng)歸補血湯組相比模型組其紅細(xì)胞數(shù)有所上升。結(jié)果見表1。

表1 當(dāng)歸補血湯對腹水型小鼠紅細(xì)胞數(shù)的影響±S)

3.2.2 當(dāng)歸補血湯對腹水型小鼠血紅蛋白含量的影響

實驗數(shù)據(jù)表明，與正常組相比，模型組血紅蛋白含量明顯減少，當(dāng)歸補血湯組相比模型組其血紅蛋白含量逐漸上升，提示當(dāng)歸補血湯可能對抗癌性貧血。結(jié)果見表2。

表2 當(dāng)歸補血湯對腹水型小鼠血紅蛋白含量的影響±S)

3.3 當(dāng)歸補血湯對小鼠骨髓有核細(xì)胞生長的影響

從表3可知，荷瘤小鼠骨髓生長受到抑制，小鼠死亡時模型組和當(dāng)歸補血湯組骨髓有核細(xì)胞明顯少于正常組。經(jīng)過24h、48h培養(yǎng)，骨髓有核細(xì)胞逐漸調(diào)亡，從圖2斜率來看，模型組骨髓有核細(xì)胞體外培養(yǎng)調(diào)亡最快，當(dāng)歸補血湯組次之，說明對骨髓細(xì)胞有保護(hù)作用。

表3 當(dāng)歸補血湯對腹水型小鼠骨髓有核細(xì)胞生長的影響

4 討論

骨髓是腫瘤轉(zhuǎn)移好發(fā)部位，腫瘤細(xì)胞浸潤可直接抑制骨髓造血干細(xì)胞增殖，消耗造血物質(zhì)；釋放癌性代謝產(chǎn)物損傷骨髓。骨髓涂片可見增生低下及與原發(fā)病相應(yīng)的瘤細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞浸潤還可導(dǎo)致骨髓纖維化。荷瘤小鼠特別是腹水瘤小鼠貧血更加嚴(yán)重，可能是由于腹水瘤小鼠產(chǎn)生大量腹水造成體內(nèi)蛋白大量流失，血紅蛋白量減少造成，所以本實驗用腹水瘤小鼠造成貧血模型再用藥物進(jìn)行治療更能說明問題。[6-8]

動物實驗由于腹水瘤小鼠生存期有限只能觀察給藥一段時間后小鼠骨髓造血功能的狀況。我們在小鼠存活且給藥10d治療后處死小鼠，通過體外培養(yǎng)觀察骨髓造血干細(xì)胞的狀態(tài)及調(diào)亡情況，發(fā)現(xiàn)腹水模型組小鼠造血干細(xì)胞存活率偏低，調(diào)亡快，我們用腹水瘤小鼠血清刺激正常骨髓造血細(xì)胞發(fā)現(xiàn)存在炎性因子會加快正常骨髓造血細(xì)胞調(diào)亡，說明癌癥造成小鼠出現(xiàn)貧血主要是由于癌性因子對骨髓造血細(xì)胞抑制造成的。當(dāng)歸補血湯能有效修復(fù)骨髓造血干細(xì)胞延緩其調(diào)亡速度。

[1]韓金鳳，王芳．癌性貧血的研究進(jìn)展[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2009，11(10)：198-199．

[2]張三印，馮蓓，楊苗，等.當(dāng)歸補血湯抑制與腫瘤共培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖及其分子機制[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2013,19(2):151.

[3]苗明三，方曉艷.當(dāng)歸補血湯粗多糖對免疫抑制小鼠免疫功能的影響[J].中藥藥理與臨床,2003,19(6):8.

[4]嚴(yán)蘇純，祝彼得，韓英光，等.當(dāng)歸補血湯不同制劑對骨髓抑制小鼠造血調(diào)控的實驗研究[J].2008，6(25):229-231.

[5]解景田，劉燕強，崔庚演，等．生理學(xué)實驗[M].北京：高等教育出版社，2011，12(4)：62-65.

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[8]蔡琨，馮泳，何前松．小半夏加茯苓湯對H22荷瘤小鼠的抑瘤及免疫調(diào)節(jié)作用[J].實用醫(yī)學(xué)雜志，2011，27(7)：1 290-1 292.

征稿啟事

《江西中醫(yī)藥》所設(shè)的重點欄目有《明醫(yī)心鑒》、《滕王閣醫(yī)話》等?！睹麽t(yī)心鑒》以介紹名老中醫(yī)經(jīng)驗和中醫(yī)臨證心得為主，重點刊載中醫(yī)關(guān)于疑難病的診療經(jīng)驗，要求觀點、方法新，經(jīng)驗獨到。《滕王閣醫(yī)話》主要反映中醫(yī)教學(xué)、科研、臨床的一得之見，要求以小見大，有感而文，語言生動流暢，可讀性強，富于知識性、趣味性。

ResearchofAngelicaBloodTonicSoupinTreatmentofCarcinomaofAnemia

CAOJuan1*,HUANYu-mei2

1.Children'shospitalofjiangxiprovince,Nanchang330006;2.Collegeofnanchanguniversityofscienceandtechnology,Nanchang330029

Clinical studies have shown that cancer more than 50% incidence of anemia, anemia can affect the tumor treatment, reduce the patient's quality of life, even life threatening. Objective: to study the different concentration of angelica blood tonic soup on a tumor-burdened mice blood tonic effect. Methods: H22mice ascites of good growth model is set up, a tumor-burdened mice were randomly divided into two groups (model group, angelica blood tonic soup), in addition to choose 12 healthy mice as blank control group (normal group). Give the normal group and model group mice lavage daily physiological saline, angelica group was given angelica blood blood tonic soup decoction lavage (dose of 12 g- kg-d-1). Grouping after dosing 10 days in a row, on time delivery at the end of the 24 h after eyeball blood executed collect in mice bone marrow. Results: the experimental data show that, compared with normal group, model group significantly reduced number of red blood cell and hemoglobin content and suggest possible cancer anemia phenomenon. Angelica blood tonic soup group compared with model group the number of red blood cells, hemoglobin increased, and suggest possible angelica blood tonic soup for cancer anemia. Groups of bone marrow cells in vitro, angelica blood tonic soup group can slow cancer anemia mice bone marrow apoptosis velocity of red blood cell precursors. Conclusion: angelica blood tonic soup for a tumor-burdened mice has a role in blood.

Angelica Blood Tonic Soup; A Tumor-burdened H22. Anti-tumor; Anemia

曹娟，女，碩士，主管藥師，從事臨床藥學(xué)相關(guān)工作，Tel:13576956541，E-mail：caojuan0166@126.com。

R556.9 R730.6 R242

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2013-10-10)