★ 侯莉偉 楊明 熊永愛 楊鳳梅 鄒文銓

(1.成都中醫(yī)藥大學藥學院 成都 611137；2.江西中醫(yī)學院現(xiàn)代中藥制劑教育部重點實驗室 南昌 330004；3.四川大學分析測試中心 成都 610054)

Box-Behnken設計優(yōu)化回流提取山楂降脂有效成分的工藝研究

★ 侯莉偉1*楊明1,2**熊永愛1楊鳳梅1鄒文銓3

(1.成都中醫(yī)藥大學藥學院 成都 611137；2.江西中醫(yī)學院現(xiàn)代中藥制劑教育部重點實驗室 南昌 330004；3.四川大學分析測試中心 成都 610054)

目的：優(yōu)化回流提取山楂降脂有效成分的工藝。方法：在單因素實驗的基礎上，采用回流提取法，選取乙醇體積分數(shù)、溶媒用量、提取時間為考察因素，以熊果酸、金絲桃苷得率及干膏率的加權平均值為指標，通過Box-Behnken響應面設計優(yōu)化提取工藝。結果：最佳提取工藝為：乙醇體積分數(shù)70%、溶媒用量12倍、提取時間100min、提取2次。在此條件下，熊果酸、金絲桃苷得率分別為0.548%、0.093%，干膏率33.92%，與模型預測值較接近。結論：優(yōu)化的提取工藝穩(wěn)定可行，可為山楂降脂成分的進一步研究提供參考。

山楂；Box-Behnken設計；熊果酸得率；金絲桃苷得率；干膏率；加權平均值

山楂為薔薇科植物山里紅Crataegus pinnatifida Bge.var.majorN.E.Br.或山楂Crataegus pinnatifida Bge.的干燥成熟果實。性味酸甘，具有消食健胃，行氣散瘀，化濁降脂的功效。用于治療肉食積滯，瘀血經(jīng)閉，高脂血癥等，[1]被列入衛(wèi)生部公布的《關于進一步規(guī)范保健食品原料管理的通知》藥食兩用的名單之中。主要含有黃酮類和三萜酸類等成分。金絲桃苷、熊果酸是山楂黃酮和三萜類物質的主要成分，是山楂降血脂的活性成分。[2-4]本實驗采用回流提取法，以熊果酸、金絲桃苷得率和干膏率的加權平均值(R1)為考察指標，通過Box-Behnken實驗設計對回流提取山楂降脂有效成分的工藝進行優(yōu)化，從而確定最佳提取工藝參數(shù)。為山楂降脂藥效和制劑的研究提供依據(jù)和參考。

1 儀器與材料

N2000型高效液相色譜儀(日本島津公司)，UV-1700型紫外分光光度計(日本島津公司)，DZF-1B型真空干燥箱(上海躍進醫(yī)療器械廠)，BSA224S型電子天平(北京賽多利斯科學儀器有限公司)，DZKW-4型電熱恒溫水浴鍋(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)，SZ-93型自動雙重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)，KQ-400DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

山楂飲片(四川科倫天然藥業(yè)有限公司，批號121009，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學藥學院盧先明教授鑒定為薔薇科植物山楂Crataegus pinnatifida Bge.的干燥成熟果實)；熊果酸對照品(成都瑞芬思生物科技有限公司，批號X-006-130124)；金絲桃苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號111521-201205)；乙腈(色譜純，F(xiàn)isher公司)；水(雙蒸水，自制)；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 供試品溶液的制備 稱取山楂粗粉5.00g于100mL圓底燒瓶中，加無水乙醇30mL，回流提取2次，每次1h，合并2次濾液，于50mL容量瓶中，加無水乙醇至刻度，即得。

2.2 熊果酸的含量測定

2.2.1 對照品溶液的配制 精密稱定熊果酸對照品12.2mg于25mL容量瓶中，加無水乙醇適量，超聲處理使溶解完全，加無水乙醇至刻度，搖勻，得0.488mg/mL的熊果酸對照品溶液。

2.2.2 色譜條件 色譜柱為Agilent TC-C18(2)柱(4.6mm×250mm，5μm)，流動相為乙腈-0.3%磷酸水(77∶23)，流速1 mL/min，柱溫25℃，檢測波長212nm，進樣量10μL。

2.2.3 專屬性 分別按照“2.2.2”項下色譜條件進行空白、對照品和供試品溶劑的測定，結果表明該方法專屬性良好，各成分和溶劑間無干擾。

2.2.4 標準曲線的繪制 準確吸取熊果酸對照品1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5mL，分別于10mL容量瓶中，無水乙醇定容至刻度，搖勻。按照“2.2.2”項下進行測定，以峰面積為縱坐標(Y)，濃度為橫坐標(X)繪制標準曲線，得回歸方程Y=3.3×106X+76673，r=0.9996，說明熊果酸在0.0488-0.1708mg/mL范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關系。

2.3 金絲桃苷的含量測定

2.3.1 對照品溶液的配制 精密稱定金絲桃苷對照品10.2mg于50mL容量瓶中，加甲醇適量，超聲處理使溶解完全，加甲醇至刻度，搖勻，得0.204mg/mL的金絲桃苷對照品溶液。

2.3.2 顯色試劑的配置 準確稱取A1Cl31.34g，于100mL容量瓶中，加甲醇至刻度，配制成0.1mol/L的溶液。準確稱取CH3COONa·3H2O 2.72g，于100mL容量瓶中，加蒸餾水溶解至刻度，配制成0.2mol/L的溶液。精密吸取1.15mL冰醋酸，于100mL容量瓶中，蒸餾水稀釋至刻度，配制成0.2mol/L的溶液[5]。

2.3.3 標準曲線的繪制 準確吸取金絲桃苷對照品1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0mL，分別于25mL容量瓶中，加1mL pH為5.2的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液和2mL 0.1mol/L A1Cl3溶液，甲醇定容到刻度，搖勻，40℃水浴顯色10min。[5]以相應試劑為空白，照紫外-可見分光光度計(附錄ⅤA)，在409nm處測吸光度。以吸光度(Y)為縱坐標，濃度(X)為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程Y=12.675X-0.0133，r=0.9994，說明金絲桃苷在0.00816-0.04896mg/mL范圍內(nèi)與吸光度有良好的線性關系。

2.4 干膏率的測定 量取提取液50mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，揮干溶劑，于105℃烘箱干燥3h，干燥器中冷卻30min，迅速精密稱定重量，即干膏重。

2.5 數(shù)據(jù)處理 以熊果酸得率(Y1)、金絲桃苷得率(Y2)和干膏率(Y3)的加權平均值(R1)為綜合評價指標。R1=(x1×f1/x1max+x2×f2/x2max+x3×f3/x3min)×100，其中x1、x2、x3分別表示熊果酸、金絲桃苷得率和干膏率，鑒于金絲桃苷和熊果酸均為山楂降脂的活性成分，故二者取相同的權重系數(shù)，均設為0.4。在有效成分明顯的前提下，干膏率越高則純度越低，故設其權重系數(shù)為-0.2。[6-7]

2.6 單因素實驗結果

2.6.1 乙醇體積分數(shù) 稱取山楂粗粉6份，每份5.00g，分別加入8倍量體積分數(shù)為40%，50%，60%，70%，80%，90%的乙醇，回流提取2次，每次1h，合并2次濾液，按“2.2.2、2.3.3、2.4”項下測定熊果酸、金絲桃苷得率和干膏率并計算R1值。結果分別為12.68，24.79，43.65，54.75，32.97，28.29，表明70%乙醇提取R1達最大值。

2.6.2 溶媒倍數(shù) 稱取山楂粗粉6份，每份5.00g，分別加入6，8，10，12，14，16倍量70%的乙醇，回流提取2次，每次1h，合并2次濾液，按“2.2.2、2.3.3、2.4”項下測定熊果酸、金絲桃苷得率和干膏率并計算R1值。結果分別為15.09，27.10，46.56，59.65，55.20，55.47，表明12倍量溶媒提取R1達最大值。

2.6.3 提取時間 稱取山楂粗粉6份，每份5.00g，分別加入12倍量70%的乙醇，回流提取0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0h，提取2次，合并2次濾液，按“2.2.2、2.3.3、2.4”項下測定熊果酸、金絲桃苷得率和干膏率并計算R1值。結果分別為40.56，52.53，57.01，55.03，38.64，34.14，表明提取1.5hR1達最大值。

2.6.4 提取次數(shù) 稱取山楂粗粉6份，每份5.00g，分別加入12倍量70%的乙醇，回流提取1，2，3，4次，每次1.5h，合并濾液，按“2.2.2、2.3.3、2.4”項下測定熊果酸、金絲桃苷得率和干膏率并計算R1值。結果分別為13.51，35.72，41.13，44.68，結合生產(chǎn)成本考慮，選擇提取2次。

2.7 Box-Behnken設計

綜合相關文獻報道及單因素實驗，影響提取工藝的主要因素有乙醇體積分數(shù)(A)、溶媒倍數(shù)(B)、提取時間(C)。故以這3個因素為主要考察因素，提取2次，以R1為綜合評價指標進行實驗設計。因素水平見表1。

表1 Box-Behnken實驗因素水平表

2.8 模型擬合

按照Box-Behnken實驗設計要求，應用Design-Expert軟件以R1對各因素進行二次多項式方程擬合。Box-Behnken設計及結果見表2，回歸方程方差分析見表3。

由表3方差分析可見，A2、C2為顯著性影響因素，C為極顯著性影響因素。在總的作用因素中，平方項對R1的影響最為顯著，其次為一次項，交互項的影響較小。模型的顯著性水平P=0.0177<0.05，表明該模型方程與實際實驗擬合良好，實驗誤差較小，能充分反映實際情況。模擬方程為R1=+56.98800+4.59750A+3.24250B+9.09250C+4.00750AB-1.46250AC-6.60250BC-10.15525A2-5.01025B2-9.98025C2。

表2 Box-Behnken設計及結果

表3 回歸模型方差分析結果

2.9 效應面優(yōu)化預測及驗證結果

2.9.1 優(yōu)化工藝預測 根據(jù)二次多項式模型方程擬合結果，做出R1的效應曲面及等高線圖，見圖1。以R1對最佳提取工藝進行預測，結果為乙醇體積分數(shù)72.3%，溶媒用量12.32倍，提取時間1.69h，R1=59.53。

2.9.2 驗證實驗 考慮生產(chǎn)實際情況和操作可行性，對各因素進行取整數(shù)，則最佳提取工藝確定為：乙醇體積分數(shù)70%、溶媒用量12倍、提取時間100min、提取2次。稱取山楂最粗粉3份，每份150g，按照最佳提取工藝進行驗證實驗，結果為Y1=0.548%(RSD1.52%)，Y2=0.093%(RSD2.84%)，Y3=33.92%(RSD2.36%)。與模型預測值Y1=0.607%，Y2=0.098%，Y3=32.65%較接近，說明優(yōu)選的工藝參數(shù)較可靠。

圖1 乙醇濃度(A)、液固比(B)和提取時間(C)間的效應面及等高線圖

3 討論

Box-Behnken實驗設計能夠將復雜的未知函數(shù)關系在小區(qū)域內(nèi)用簡單的二次多項式模型進行擬合，計算比較簡便，是降低開發(fā)成本、優(yōu)化工藝條件、提高產(chǎn)品質量，解決生產(chǎn)過程中實際問題的一種有效方法。與只能對一個個獨立實驗點進行分析的正交試驗相比，其優(yōu)勢是充分考慮了實驗的隨機誤差，在考察最優(yōu)實驗條件過程中，可以連續(xù)對實驗的各個水平進行分析。并能繪制出效應曲面與等高線圖，直觀地看到因素間的變化規(guī)律。[8]實驗結果表明，加熱回流提取山楂降脂有效成分最優(yōu)工藝為：乙醇體積分數(shù)70%、溶媒用量12倍、提取時間100min、提取2次。

高脂血癥(HLP)是當今社會的常見病、多發(fā)病，是人體內(nèi)脂質代謝失常、血漿內(nèi)脂質濃度超過正常高限的一種疾病，與引起人類死亡的首要疾病，心腦血管疾病有著十分密切的關系。是動脈粥樣硬化、脂肪肝、冠心病、糖尿病、肥胖癥等的伴發(fā)癥及誘發(fā)因素。[9]現(xiàn)代藥理研究表明，山楂具有降血脂、降血壓、降血糖、活血化瘀、強心、抗氧化、抗疲勞、抗腫瘤、抑菌消炎等多種功效。[10]為消油膩肉食積滯的要藥，既可直接入藥，又可水煎代茶飲。張曼[11]通過研究山楂對HLP小鼠血脂及脂蛋白酯酶和肝酯酶的影響表明，山楂可通過提高脂蛋白脂酶、肝脂酶的活性，降低膽固醇、甘油三酯含量，且具有升高高密度脂蛋白膽固醇含量和降脂酶活性的作用。林薇等[12]對山楂降脂湯(組方為生炒山楂、荷葉、柴胡、萊菔子、生黃芪)研究表明，山楂降脂湯能顯著調節(jié)機體血脂水平，具有有效預防HLP和保護血管內(nèi)皮細胞的功能。

山楂為天然植物，能夠滿足現(xiàn)代人追求綠色自然的要求。山楂單味和復方制劑在降血脂方面的研究和開發(fā)具有較好的現(xiàn)實意義和可預測的市場前景。本研究通過以熊果酸和金絲桃苷為指標成分，確定回流提取山楂降脂有效成分的工藝參數(shù)。旨在為山楂降脂療效的研究及相關降脂中成藥的開發(fā)提供參考依據(jù)。

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征稿啟事

《江西中醫(yī)藥》所設的重點欄目有《明醫(yī)心鑒》、《滕王閣醫(yī)話》等?！睹麽t(yī)心鑒》以介紹名老中醫(yī)經(jīng)驗和中醫(yī)臨證心得為主，重點刊載中醫(yī)關于疑難病的診療經(jīng)驗，要求觀點、方法新，經(jīng)驗獨到?！峨蹰w醫(yī)話》主要反映中醫(yī)教學、科研、臨床的一得之見，要求以小見大，有感而文，語言生動流暢，可讀性強，富于知識性、趣味性。

OptimizationofRefluxExtractionofLipid-loweringComponentsinCrataegusPinnatifidaBge.byBox-BehnkenDesign

HOULi-wei1*,YANGMing1,2**,XiongYong-ai1,YANGFeng-mei1,ZOUWen-quan3

1.CollegeofPharmacy，ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine(TCM),Chengdu611137;2.KeyLaboratoryofModernPreparationofTCM，MinistryofEducation,JiangxiUniversityofTCM,Nanchang330004;3.AnalyticalandTestingCenterofSichuanUniversity,Chengdu610054

Objective:To optimize reflux extraction of lipid-lowering components from Crataegus pinnatifida Bge. Method:Based on the single factor experiments,reflux extraction method was used,with weighted means of ursolic acid yield,hyperoside yield and rate of dry extract as index.The factors such as ethanol volume fraction ,solvent dosage,extraction time were optimized by Box-Behnken response surface methodology. Result:The ursolic acid yield,hyperoside yield and rate of dry extract was 0.548%,0.093%,33.92% respectively,using ethanol volume fraction 70%,liquid-material ratio of 12:1 and extracted for 102min,twice,which was regarded as the optimum extraction process.These datas were close to model predictor. Conclusion:The optimized extraction technology was stable and practicable．It could provide the reference for further studying lipid-lowering components of Crataegus pinnatifida Bge.

Crataegus Pinnatifida Bge. ; Box-Behnken Design;Ursolic acid Yield;Hyperoside Yield;Rate of Dry Extract ; Weighted Means

侯莉偉，碩士研究生，從事中藥藥劑學研究，Tel:18782085707，E-mail:514296193@qq.com

**通訊作者：楊明，博士，教授，博士研究生導師，從事中藥新制劑研究，E-mail:yangming16@126.com

R284.3

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2013-07-31)