李秋元 林曉斌 陳杰武 郭光華

AKT又稱蛋白激酶(PKB), 其活性形式為磷酸化蛋白激酶B(P-Akt), 位于多種基因信號通路的核心部位, PI3K/AKT信號通路廣泛存在于細胞中, 是參與細胞生長﹑增殖﹑凋亡﹑分化調(diào)節(jié)的重要信號通路, 研究發(fā)現(xiàn), FR在人食管癌細胞中異常高表達［1］, 而hnRNP-E1作為FR的轉錄調(diào)節(jié)因子, 在小鼠的乳腺上皮癌中, hnRNP-E1與PI3K/AKT信號通路存在一定的關系, 但在人食管癌細胞中是否存在關聯(lián)目前尚未報道。本實驗通過PI3K/AKT信號通路靶向抑制劑LY294002對人食管癌EC109細胞作用, 以探討PI3K/AKT信號通路與FR表達之間的關系。

1 材料與方法

1.1 材料 人食管癌細胞系EC109由汕頭大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院分子生物學實驗室培養(yǎng), LY294002﹑胰蛋白酶(江蘇碧云天)﹑胎牛血清(杭州四季青), RPMI1640(無葉酸)(GIBCO公司), 二甲基亞砜﹑四甲基偶氮唑藍(MTT)﹑AKT,P-Akt抗體 (CST)﹑hnRNP-E1(Santa Cruz), FR 抗體 (ENZO)。

1.2 方法

1.2.1 LY294002工作液的配置及細胞培養(yǎng) 將20 μL(10 mg/ml)LY294002 溶液加入到 630 μLPBS 中 , 稀釋成 1000 μmol/L 的溶液, 置于-20℃冰箱中儲存, 使用前再稀釋成指定濃度, 將食管癌細胞EC109加入含10%胎牛血清的無葉酸RPMI1640培養(yǎng)基中, 置于37℃, 5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng), 每2～3 d傳代一次。

1.2.2 MTT 法檢測細胞生長活性 實驗分組：空白對照組和實驗組, 實驗組分為終濃度10﹑20﹑30﹑40﹑50 μmol/l LY294002組。取對數(shù)生長期的食管癌細胞EC109, 用0.25%胰酶消化, 離心收集后用無葉酸RPMI1640培養(yǎng)基配制成5×104個細胞/ml的懸液, 接種于96孔板, 每孔細胞數(shù)約為6000,置于37℃, 5%CO2飽和濕度條件下過夜。實驗組分別給予終濃度為 10﹑20﹑30﹑40﹑50 μmol/L LY294002, 總體積200 μL。每組5個復孔, 分別培養(yǎng)8 h﹑12 h﹑24 h后,每孔分別加入5 mg/ml的MTT10 μl繼續(xù)培養(yǎng)4 h后去上清液, 再加入DMSO150 μL,水平震蕩20 min。用酶標儀在波長490 m處測細胞增殖的抑制率：細胞抑制率=(1-實驗組平均OD490值/對照組平均OD490值)×100%

1.2.4 流式細胞術檢測食管癌細胞中FR的表達 收集經(jīng)10﹑20﹑30﹑40﹑50 μmol/L LY294002 作用 24h 后的實驗組﹑空白對照組和同型對照組細胞, 用PBS洗滌3次,棄上清,各實驗組分別加入1 ml FR-FITC, 空白對照組加入1mlPBS,同型對照組加入1ml IgG-FITC(0.25 μg/ml), 37℃避光孵育1 h后, 用PBS洗滌2次, 棄上清, 各組加入500 μlPBS懸浮細胞,上機檢測。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 LY294002對食管癌細胞EC109的生長抑制效應 MTT法檢測結果顯示, 隨著時間延長, 濃度加大, 細胞增殖抑制率呈現(xiàn)時間-效應關系, 濃度-效應關系, 各濃度組分別與其對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(*P＜0.05, 表1)

表1 LY294002對EC109細胞的增殖抑制率(±s, %)

表1 LY294002對EC109細胞的增殖抑制率(±s, %)

*P＜0.05(藥物作用組VS對照組)

LY294002濃度（μmol/l）8h 12h 24h OD值 抑制率（%） OD值 抑制率（%） OD值 抑制率（%）空白對照組 0.59±0.01 0 0.64±0.04 0 0.96±0.04 0 10 0.55±0.02* 8.11 0.59±0.02* 8.02 0.86±0.02* 10.41 20 0.54±0.01* 9.72 0.55±0.03* 13.81 0.80±0.08* 16.55 30 0.45±0.01* 23.89 0.48±0.01* 25.95 0.73±0.03* 28.72 40 0.43±0.01* 28.49 0.45±0.01* 29.63 0.67±0.06* 30.47 50 0.38±0.01* 36.45 0.40±0.01* 38.36 0.58±0.07* 39.16

3 討論

PI3K/AKT處于眾信號通路的中心地位, 其重要性日益受到關注, 研究表明多種腫瘤組織中存在AKT基因的過度表達和活化［2］, 而在食管癌組織細胞中也呈現(xiàn)出高表達狀態(tài)［3］。本實驗通過使用PI3K/AKT 信號通路特異性抑制劑LY294002作用于人食管癌EC109細胞, 采用MTT法檢測細胞的增殖抑制率, 實驗結果顯示, 隨著藥物作用濃度的增大和作用時間的延長, 增殖抑制率逐漸降低, 存在統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。其機制可能是LY294002通過抑制AKT的磷酸化水平, 使得細胞周期蛋白降解增加﹑表達減少, 促使細胞停滯于G0/G1期, 細胞增殖明顯受到抑制, 死亡細胞增多。

葉酸, 又名維生素B11, 是一種水溶性維生素, 在體內(nèi)參與一碳單位的轉移反應和嘌呤﹑胸腺嘧啶的合成, 葉酸缺乏與DNA損傷﹑修復和甲基化異常密切相關, 而后者是腫瘤發(fā)生的重要環(huán)節(jié), hnRNP E1可調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性, 同時參與成熟mRNA的轉運, 定位［4］。本實驗用LY294002作用食管癌細胞24h后, 用流式細胞技術檢測FR的表達水平。結果顯示FR的表達較對照組明顯降低, 提示葉酸受體的表達與PI3K/AKT通路存在一定的聯(lián)系, 其中, 可能與抑制PI3K/AKT通路, 使得細胞增殖減少, 從而所需的葉酸受體減少有關, 另一方面也可能是通過抑制通路PI3K/AKT,影響了hnRNP-E1的磷酸化水平, 而hnRNP-E1做為FR轉錄的調(diào)控因子, 可進一步影響FR的轉錄, 最終使得FR的表達減少。

綜上所述, 阻斷PI3K/AKT信號轉導通路可以明顯抑制人食管癌EC109細胞的增殖, 同時影響FR的表達, 但FR是否可反作用通過PI3K/AKT信號轉導通路作用食管癌細胞的生物學行為有待進一步研究。

［1］ 劉璇芝, 陳素鉆, 俞晶, 荊緒斌, 李秋元, 郭光華.葉酸受體α在食管癌及癌旁組織表達和患者飲食習慣的關系.廣東醫(yī)學,2008,26(3):456-458.

［2］ Mariette C, Finzi L, Fabre S, et al Factors predictive of complete,resection of operable esophageal cancer: a prospective study.Ann Thorac Surg, 2003, 75(6): 1720-6.

［3］ 曹偉, 于在誠, 劉芝華, 駱愛萍.磷酸化AKT在食管鱗癌中的表達及其臨床意義.安徽醫(yī)科大學學報, 2008,45(1):24-4

［4］ Parkin DM, Bray F, Ferlay J, et al.Global Cancer Statistics, 2002.CA Cancer J Clin,2005,55(2):74-108.