王文婷，劉昕，余群力，田甲春，師希雄，李儒仁

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州，730070)

牦牛(Bos grunniens)，是我國(guó)青藏高原的珍稀畜種。天然的牧草高原使其肉質(zhì)細(xì)嫩，具有高蛋白、低脂肪等優(yōu)點(diǎn)，是消費(fèi)者青睞的綠色食品［1－2］。嫩度是評(píng)判肉質(zhì)優(yōu)劣最常用的指標(biāo)［3］。肉類(lèi)成熟過(guò)程中嫩度的增加主要是由內(nèi)源蛋白酶水解肌原纖維造成的［4－5］。目前研究發(fā)現(xiàn)，組織蛋白酶(Cathepsin)是主要的蛋白水解系統(tǒng)之一，在肉類(lèi)成熟后期發(fā)揮作用［6－7］。組織蛋白酶位于溶酶體內(nèi)，L、B、D、H 型與肌肉成熟有密切關(guān)系［8－9］，尤以L(fǎng) 型活性最強(qiáng)，可專(zhuān)一性地水解熒光合成底物Z-Phe-Arg-MCA［10］。

目前，已有文獻(xiàn)報(bào)道從小鼠、鯉魚(yú)等中提取了組織蛋白酶B、L［11－12］，提取工藝的優(yōu)化多數(shù)直接采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)和分析法，事實(shí)上這種方法在確定響應(yīng)面中心點(diǎn)之前并未進(jìn)行全面的篩選，僅憑單因素試驗(yàn)或文獻(xiàn)參考值，存在一定局限性，會(huì)降低試驗(yàn)的準(zhǔn)確性和模型預(yù)測(cè)實(shí)際值的精確性。本試驗(yàn)以牦牛肉為研究對(duì)象，首次將一套完整的響應(yīng)面法［13］:Plackett-Burman 試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)、中心組合設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析法應(yīng)用于提取工藝條件的全面優(yōu)選。關(guān)于牦牛肉中組織蛋白酶L 提取工藝如此系統(tǒng)性的優(yōu)化研究國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道，因此為進(jìn)一步分離純化組織蛋白酶L 奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

酰胺甲基香豆素(AMC)、芐氧羰基-苯丙氨酰-精氨酰-酰胺-甲基香豆素(Z-Phe-Arg-AMC)、芐氧羰基-精氨酰-精氨酰-酰胺-甲基香豆素(Z-Arg-Arg-AMC)、精氨酰-酰胺-甲基香豆素(L-Arg-AMC)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、半胱氨酸(L-Cys)、β-巰基乙醇(β-ME)，購(gòu)于美國(guó)Sigma 公司;乙二醇-雙-(2-氨基乙基)四乙酸(EGTA)、聚環(huán)氧乙烷23 月桂醚(Brij35)，購(gòu)于美國(guó)Amresco 公司;乙二胺四乙酸(EDTA)、(NH4)2SO4、乙酸鈉、氯乙酸鈉等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

RF5301-PC 熒光分光光度計(jì)，日本島津公司;XiangYi H-1850R 高速離心機(jī)，湘儀離心機(jī)儀器有限公司;756P 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司;DS-1 型組織搗碎機(jī)，金壇市金南儀器廠;HHS型電熱恒溫水浴鍋、AL104 型電子天平，上海佑科儀器儀表有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 牦牛肉組織蛋白酶L 粗酶液的提取

取牦牛背最長(zhǎng)肌肉樣100 g，去除脂肪、結(jié)締組織，加入一定體積比(肉樣質(zhì)量:浸提緩沖液體積)、經(jīng)優(yōu)化的浸提緩沖液(一定濃度、一定pH 值，含一定濃度L-Cys、一定濃度PMSF)進(jìn)行勻漿，冷凍離心(10 000 ×g，30 min，4℃)，所得沉淀用含0.5 mol/L NaCl 的浸提緩沖液反復(fù)溶解離心2 次，混合所有上清液用一定飽和度的(NH4)2SO4沉淀［14］，于4℃充分鹽析后離心，所得沉淀用含0.2 mol/L NaCl 的浸提緩沖液溶解并充分透析，并用截留分子量為10 ku 的超濾管將透析液濃縮到適當(dāng)體積，即得組織蛋白酶L 酶液。

1.2.2 牦牛肉組織蛋白酶L 濃度的測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)法，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品。取粗酶液10 μL，加水至1 mL，加入5 mL 考馬斯亮藍(lán)，震蕩搖勻5 min 后用紫外分光光度計(jì)測(cè)595 nm 處吸光值。

1.2.3 牦牛肉組織蛋白酶L 活性的測(cè)定

參照Futoshi Aranishi［15］的方法并予以改進(jìn)。測(cè)定時(shí)反應(yīng)體系為980 μL 0.1% Brij35，400 μL 0.4 mol/L 乙酸鈉緩沖液(含5 mmol/L EDTA，pH5.5)，200 μL 10 mmol/L L-Cys 和200 μL 酶液。混合液于40℃水浴2 min，然后加入400 μL 25 μmol/L 的底物Z-Phe-Arg-AMC，在相同的溫度下反應(yīng)30 min 后，加入3 mL 終止液(0.1 mol/L 乙酸鈉包含0.1 mol/L 氯乙酸鈉，pH4.3)終止反應(yīng)。利用熒光分光光度計(jì)測(cè)定其熒光強(qiáng)度，所用的激發(fā)波長(zhǎng)(Excitation)為380 nm，發(fā)射波長(zhǎng)(Emission)為460 nm。

1 個(gè)酶活單位(U):在最適反應(yīng)溫度(40℃)及反應(yīng)pH(5.5)條件下，每分鐘內(nèi)催化1 μmol AMC 轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量(1 μmol AMC/min)。

酶比活力單位:U/mg(測(cè)定時(shí)所用的蛋白含量)

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在7 個(gè)因素中篩選主效因素，每個(gè)因素選取高(+1)低(－1)兩個(gè)水平。試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1(N=12)。

表1 Plackett-Burman 試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman

1.3.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)( steepest ascent design)

根據(jù)Plackett-Burman 試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)顯著因素的最陡爬坡路徑，爬坡方向根據(jù)實(shí)驗(yàn)值變化的梯度方向確定，變化步長(zhǎng)根據(jù)各因素效應(yīng)值的大小來(lái)確定［16］。

1.3.3 響應(yīng)面分析法( Response surface analysis)

響應(yīng)面分析法，是一種試驗(yàn)條件尋優(yōu)的方法。與正交試驗(yàn)相比，優(yōu)勢(shì)在于可以連續(xù)地對(duì)試驗(yàn)的各個(gè)水平進(jìn)行分析，而正交試驗(yàn)只能對(duì)孤立點(diǎn)進(jìn)行分析［17］。

1.4 SDS-PAGE 電泳對(duì)牦牛肉組織蛋白酶L 的鑒定

對(duì)提取的牦牛肉組織蛋白酶L 進(jìn)行SDS-PAGE電泳［18］分析?？捡R氏亮藍(lán)染色，脫色至條帶清晰可見(jiàn)為止。凝膠照相，7%的冰醋酸保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

運(yùn)用Minitab16 進(jìn)行分析，試驗(yàn)結(jié)果及主效應(yīng)分析結(jié)果分別見(jiàn)表2、表3。

表2 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 The experiment design and results of Plackett-Burman

由表3 知，對(duì)牦牛肉組織蛋白酶L 酶活力有顯著影響的因素有X1、X2及X5，其中，浸提緩沖液pH 值影響極顯著(P＜0.01)，且這3 個(gè)因素對(duì)酶活力呈現(xiàn)出正效應(yīng)。其他因素在95%的水平上不顯著。因此選擇浸提緩沖液pH 值、L-Cys 及(NH4)2SO4飽和度作為最陡爬坡實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象。

2.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)2.1 篩出的3 個(gè)顯著因素及其效應(yīng)，設(shè)定最陡爬坡實(shí)驗(yàn)步長(zhǎng)及爬坡方向。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 Plackett-Burman 試驗(yàn)各因素主效應(yīng)分析(α=0.05)Table 3 Analysis of the main effect of each factor for Plackett-Burman(α=0．05)

表4 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 The experiment design and results of steepest ascent

由表4 知，第3 組試驗(yàn)提取的牦牛肉組織蛋白酶L 的酶活力最高，即浸提緩沖液pH 值為5.0、L-Cys濃度為7.0 mmol/L、(NH4)2SO4飽和度為80%時(shí)，酶活力最高為13.38 U/mg。因此以試驗(yàn)3 的條件作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平的中心點(diǎn)。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化牦牛肉組織蛋白酶L 提取工藝

2.3.1 回歸方程及方差分析

在2.1 和2.2 基礎(chǔ)之上，以組織蛋白酶L 的酶活力為響應(yīng)值，運(yùn)用Design expert 8.0 進(jìn)行3 因素3 水平響應(yīng)面中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)。試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)及結(jié)果分別見(jiàn)表5 和表6。

表5 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平Table 5 Factors and levels of Central composite design

采用Design expert 8.0 對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，方差分析見(jiàn)表7。所得多項(xiàng)式回歸模型為:Y=13.82+0.39A－0.30B+0.32C－0.076AB－0.63AC+0.64BC－0.47A2－0.54B2－0.65C2。該模型在α =0.01 的水平上高度顯著，失擬項(xiàng)不顯著(P＞0.05)。復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=91.03%，與實(shí)際值的擬合度很好。根據(jù)回歸方程各個(gè)系數(shù)絕對(duì)值的大小可判斷3 個(gè)因素對(duì)牦牛肉組織蛋白酶L 酶活力的影響順序?yàn)榻峋彌_液pH 值＞(NH4)2SO4飽和度＞L-Cys。

表6 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 The experiment design and results of Central composite design

表7 中心組合試驗(yàn)回歸模型方差分析Table 7 Variance analysis for regression model of Central composite design

2.3.2 響應(yīng)面分析及工藝參數(shù)的確定

根據(jù)回歸方程作3 因素兩兩交互作用的響應(yīng)面圖和等高線(xiàn)圖。從圖1 ～圖3 可以看出，浸提緩沖液pH 值和(NH4)2SO4飽和度、L-Cys 和(NH4)2SO4飽和度的交互作用顯著，浸提緩沖液pH 值和L-Cys 交互作用不顯著。

對(duì)回歸模型進(jìn)行數(shù)學(xué)分析，得出牦牛肉組織蛋白酶L 最佳提取工藝參數(shù)為:浸提緩沖液pH 值5.68、L-Cys 濃度為6.48 mmol/L、(NH4)2SO4飽和度為76.63%。在此最優(yōu)工藝條件下，牦牛肉組織蛋白酶L 的提取率為46.2%，酶活力為13.98 Unit/mg。

圖1 A(浸提緩沖液pH)與B(L-Cys)交互響應(yīng)面圖(a)及其等高線(xiàn)圖(b)Fig．1 A(pH of extraction buffer solution)and B(L-Cys)interaction response surface and contour line graph

圖2 A(浸提緩沖液pH)與C(硫酸銨飽和度)交互響應(yīng)面圖(a)及其等高線(xiàn)圖(b)Fig．2 A(pH of extraction buffer solution)and C (ammonium sulfate saturation)interaction response surface and contour line graph

圖3 B(L-Cys)與C(硫酸銨飽和度)交互響應(yīng)面圖(a)及其等高線(xiàn)圖(b)Fig．3 B(L-Cys)and C(ammonium sulfate saturation)interaction response surface and contour line graph

2.3.3 驗(yàn)證性試驗(yàn)

為進(jìn)一步驗(yàn)證模型的可靠性，在最優(yōu)工藝條件下進(jìn)行提取，實(shí)得牦牛肉組織蛋白酶L 酶活力為13.85 U/mg，與理論值相比，相對(duì)誤差為0.94%。因此，該模型合理有效，得到的最優(yōu)提取工藝參數(shù)真實(shí)可靠。

2.4 SDS-PAGE 電泳對(duì)牦牛肉組織蛋白酶L 的鑒定

SDS-PAGE 電泳圖譜可知，可辨別的蛋白帶很多，說(shuō)明粗酶液中蛋白種類(lèi)繁多。文獻(xiàn)報(bào)道的組織蛋白酶L 分子量通常在23 ku 到30 ku 之間［19－20］。濃縮后其中一條主帶非常明顯，分子質(zhì)量約為35 ku，即為分離提取的牦牛肉組織蛋白酶L。其分子質(zhì)量與已有報(bào)道基本一致，差異可能是提取組織蛋白酶L的原料不同造成的。因此試驗(yàn)所篩選的工藝參數(shù)可以有效提取牦牛肉組織蛋白酶L，獲得的目的酶的濃度和活力較高。

圖4 牦牛肉組織蛋白酶L 分離過(guò)程的SDS-PAGE 圖譜Fig．4 SDS-PAGE of Cathepsin L from yak meat in the extraction processing

3 結(jié)論

(1)通過(guò)對(duì)Plackett-Burman 試驗(yàn)回歸系數(shù)顯著性分析，發(fā)現(xiàn)對(duì)牦牛肉組織蛋白酶L 酶活力影響顯著的因素有浸提緩沖液pH 值、L-Cys 和(NH4)2SO4飽和度，而乙酸鈉緩沖液、H3PO4緩沖液、β-ME、PMSF、肉樣與緩沖液體積比在試驗(yàn)設(shè)定的范圍內(nèi)影響不顯著。

(2)通過(guò)對(duì)擬合二次方程中回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)分析，發(fā)現(xiàn)顯著影響牦牛肉組織蛋白酶L 酶活力的3 個(gè)主要因素依次為:浸提緩沖液pH 值＞(NH4)2SO4飽和度＞L-Cys。

(3)通過(guò)中心組合設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析獲得的最佳工藝參數(shù)為:浸提緩沖液pH 值5.68、L-Cys 濃度為6.48 mmol/L、(NH4)2SO4飽和度為76.63%。在最優(yōu)工藝條件下，牦牛肉組織蛋白酶L 的提取率為46.2%，酶活力為13.98 U/mg。實(shí)測(cè)值為13.85 U/mg，相對(duì)誤差為0.94%，說(shuō)明回歸模型切實(shí)可行。

(4)試驗(yàn)在Plackett-Burman 試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)基礎(chǔ)上，快速有效找出響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)，提高了中心組合設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。通過(guò)SDS-PAGE 試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，所采用的這一整套系統(tǒng)化的優(yōu)選方法為牦牛肉組織蛋白酶L 的提取工藝提供了擬合度很高的模型，更準(zhǔn)確地代替真實(shí)試驗(yàn)點(diǎn)對(duì)酶活力進(jìn)行預(yù)測(cè)，具有一定的實(shí)用性。

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