劉書臣，廖明濤，趙巧靈，林森森，戴志遠，2

1(浙江工商大學水產(chǎn)品加工研究所，浙江 杭州，310012)

2(浙江省水產(chǎn)品加工技術(shù)研究聯(lián)合重點實驗室，浙江 杭州，310012)

金槍魚(tuna)，又名鮪魚、吞拿魚，是一種生活在海洋中上層，分布在太平洋、大西洋和印度洋的熱帶、亞熱帶和溫帶廣闊水域的高度跨洋性的洄游魚類［1］。金槍魚肉質(zhì)柔嫩鮮美，蛋白質(zhì)含量高，氨基酸配比優(yōu)越，富含DHA、EPA 等具有生物活性的高度不飽和脂肪酸，是世界營養(yǎng)學會推薦的3 大營養(yǎng)魚之一，有“海底雞”的美譽。大目金槍魚是金槍魚屬中產(chǎn)量僅次于黃鰭金槍魚的種類，占全球金槍魚產(chǎn)量的10%左右，年產(chǎn)量約45 萬噸，常以生魚片、罐頭的形式食用，具有極高的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

魚類和甲殼類水生動物具有易腐敗的特性，許多指標已經(jīng)被用來對魚類的鮮度進行判定，包括感官評定、K 值、TVB-N 和菌落總數(shù)等［2－4］。金槍魚除了具有易腐敗的特性以外，其體內(nèi)還含有較多的游離組氨酸，當魚捕撈后，若不能進行迅速、正確的處理，在產(chǎn)組胺菌的作用下，魚肉中的組氨酸經(jīng)過脫羧作用會產(chǎn)生大量的組胺［5－6］，組胺攝入量達8 ～40 mg 即可引起人體輕微中毒。已有的研究表明，溫度對組胺的產(chǎn)生影響非常大［7］。目前國內(nèi)外有關(guān)金槍魚保鮮的研究較少，現(xiàn)有的研究主要集中在凍藏中的質(zhì)量變化方面，而且關(guān)于溫度對大目金槍魚組胺變化影響的研究也極為少見。隨著我國遠洋漁業(yè)的發(fā)展和人民生活水平的提高，大目金槍魚的消費需求越來越高，有關(guān)大目金槍魚鮮度和組胺變化的研究顯得尤為重要。本研究以大目金槍魚背部肌肉為研究對象，以感官評定、K 值和菌落總數(shù)為指標研究溫度對大目金槍魚鮮度變化的影響，同時研究不同貯藏溫度下大目金槍魚肉中組胺的變化。旨在幫助消費者食用安全優(yōu)質(zhì)的金槍魚，同時為金槍魚的精深加工提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大目金槍魚背部肌肉，購自寧波豐盛食品有限公司，放于－50℃冰箱凍藏備用。

1.2 主要試劑與儀器

組胺標準品、ATP 關(guān)聯(lián)物(ATP、ADP、AMP、IMP、HxR、Hx)標準品、丹磺酰氯，均購自Sigma 公司;甲醇、乙腈為色譜純，購自美國TEDIA 公司;其余試劑均為市售分析純。

冰箱，青島海爾股份有限公司;2695 高效液相色譜儀，美國waters 公司;Mili-Q 超純水機Gradient 型，美國Millipore 公司;Ultra-Turrax T18 basic 均質(zhì)機，德國IKA;RC-6 Plus 高速冷凍離心機，美國熱電儀器有限公司;SW-CJ-IFD 超凈工作臺，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品貯藏實驗

取凍藏于－50℃冰箱的冷凍魚塊放入40℃、4%的鹽水中預解凍5 min，用布片吸去魚塊表面的水分，放入4℃冷藏室進行1 h 均溫處理［1］。將處理后的金槍魚塊切成5 ×2 ×0.5 cm 的魚片，然后置于不同條件下進行貯藏實驗，以魚肉中心溫度達到各貯藏溫度時開始實驗。0℃每2 天取樣，4℃每天取樣，15℃每12 h 取樣，25℃每6 h 取樣，用于感官評定，菌落總數(shù)、K 值和組胺含量的測定。所有分析均取3 個平行樣。

1.3.2 感官評定

金槍魚片的感官評定參照Nejib Guizani［8］的方法，并作修改。根據(jù)實驗需要，從色澤、質(zhì)地和氣味3方面進行感官評價。由6 位經(jīng)過培訓的感官評定人員組成感官評定小組，對金槍魚片的色澤、質(zhì)地、氣味進行評價并打分，綜合評分為1 ～7 分，7 分品質(zhì)最好，1 分最差，4 分為可接受界限，低于4 分則表示不能食用。

1.3.3 菌落總數(shù)測定

稱取25 g 金槍魚肉于225 mL 生理鹽水中，無菌條件下均質(zhì)，制成10－1稀釋液，再進行梯度稀釋制成10－2～10－7稀釋液，根據(jù)樣品腐敗程度取合適倍數(shù)的稀釋液各1 mL 于無菌平皿，并將冷卻至46℃的平板計數(shù)培養(yǎng)基傾注平皿，于30 和15℃分別培養(yǎng)3 d 和5 d 后進行嗜溫菌和嗜冷菌的計數(shù)。

1.3.4 K 值測定

參考Yokoyama 的方法略有改動［9］。

ATP 關(guān)聯(lián)物的提取:準確稱取5.0 g 攪碎后的金槍魚肉于50 mL 離心管中，加入10 mL 10%高氯酸溶液，均質(zhì)，在4℃下離心(8 000 r/min，10 min)，取上清液。再用10 mL 5%高氯酸溶液重復提取2 次，離心，合并上清液。用KOH 溶液將其調(diào)至pH6.4，于4℃下靜置30 min。過濾除去高氯酸鉀結(jié)晶后，用超純水定容至50 mL，再用孔徑為0.22 μm 的薄膜過濾，整個過程在0 ～4℃條件下進行。

ATP 關(guān)聯(lián)物的HPLC 測定:色譜柱Sunfire C18，用pH6.4 的0.05 mol/L K2HPO4和0.05 mol/LKH2PO4(v∶v，1∶1)混合液平衡、洗脫，進樣量10 μL，流速0.8 ml/min，檢測波長254 nm。根據(jù)標準品的保留時間定性，采用外標法進行定量。

最終分解產(chǎn)物HxR 和Hx 所占總的ATP 關(guān)聯(lián)物的百分數(shù)即為鮮度指標K 值，可按下面公式計算:

式中ATP、ADP、AMP、IMP、HxR、Hx 分別代表腺苷三磷酸、腺苷二磷酸、腺苷酸、肌苷酸、次黃嘌呤核苷、次黃嘌呤的濃度(μg/mL)。

1.3.5 組胺測定

根據(jù)出入境檢驗檢疫行業(yè)標準(SNT2209 －2008)進出口水產(chǎn)品中有毒生物胺的檢測方法-高效液相色譜法進行測定。

2 結(jié)果和分析

2.1 K 值變化

大目金槍魚背部肌肉在0、4、15 和25℃下貯藏的K 值變化如圖1 和圖2 所示，金槍魚肉的初始K值為14%。一般認為作為生魚片的新鮮魚K 值在20%以下，K 值≤60%作為加工原料的鮮度標準［10］。0℃下貯藏的魚肉K 值呈緩慢的線性增長(2.6% /d，r2=0.97)，在第16 天時達到57%，其貯藏的優(yōu)質(zhì)期為2 d，貨架期為16 d;在4℃條件下，K 值增長速度較快(6.3% /d，r2=0.98)，優(yōu)質(zhì)期為1 d，貨架期為6 d，第8 天時K 值達到64%;15℃條件下的K 值變化與0℃、4℃條件下不同，K 值增長迅速(18.6% /d，r2=0.98)，經(jīng)過60 h 魚肉中的K 值就達到64%，不能食用，優(yōu)質(zhì)期為12 h;25℃下貯藏的金槍魚肉的K 值增長極為迅速(46.7% /d，r2= 0.96)，36h 后達到87%，貨架期僅為24 h，優(yōu)質(zhì)期為6h。金槍魚肉的初始K 值比較高，可能是由于金槍魚采用的是釣桿和圍網(wǎng)捕撈方式，在捕獲的過程中魚掙扎劇烈，進而影響了魚肉的初始K 值［8］。

圖1 大目金槍魚在0℃、4℃下貯藏的K 值變化Fig.1 Changes of K value in big eye tuna during storage at 0，4℃

圖2 大目金槍魚在15℃、25℃下貯藏的K 值變化Fig. 2 Changes of K value in big eye tuna during storage at 15℃、25℃

金槍魚肉的K 值在0℃、4℃下的緩慢增長和15℃、25℃下的迅速增長的差異體現(xiàn)了溫度對K 值變化的影響。魚死后其體內(nèi)的ATP 發(fā)生分解，分解按ATP→ADP→AMP→IMP→HxR→Hx 途徑進行。肌苷酸(IMP)的分解對K 值的影響較大，IMP 是在5-核苷酸酶的作用下分解的，而這種酶在0℃條件下只能維持大約6d 的穩(wěn)定，之后就會慢慢失活。0℃和4℃條件下魚肉K 值增長緩慢就是由于低溫降低了5-核苷酸酶的活性導致的，本實驗結(jié)果與Boyle［11］研究的冷藏魚肉K 值變化結(jié)果相似。Fraser［12］的研究表明，在5 ～25℃下IMP 的分解和HxR 的生成速度很快，這正好解釋了在15℃和25℃下金槍魚肉K 值迅速增長的現(xiàn)象。大目金槍魚在0℃下的貨架期比Nejib Guizani［8］研究的黃鰭金槍魚(12d)和Chang［13］所研究的海鱸魚(8d)要長;但優(yōu)質(zhì)期遠低于Ehira［14］研究的日本黑鯛魚(12 d)。

2.2 菌落總數(shù)變化

大目金槍魚背部肌肉在0、4、15 和25℃下貯藏期間的菌落總數(shù)變化如圖3 和圖4 所示。四個貯藏溫度下金槍魚肉中的嗜溫菌和嗜冷菌的菌落總數(shù)均呈增長趨勢，而且貯藏時間和貯藏溫度對菌落總數(shù)的增長影響差異性顯著(P＜0.05)。在0℃和4℃貯藏條件下，貯藏初期低溫抑制了魚肉中微生物的生長，菌落總數(shù)變化比較平緩，嗜溫菌占據(jù)優(yōu)勢地位;隨著貯藏時間的延長，蛋白質(zhì)、糖類等物質(zhì)的分解為微生物的增長提供了良好的條件，微生物適應低溫環(huán)境，生長速度加快，嗜冷菌的增長速度高于嗜溫菌的增長速度，并逐漸占據(jù)優(yōu)勢。15℃和25℃下貯藏的魚肉中，嗜溫菌和嗜冷菌的增長速度明顯高于0℃、4℃下貯藏的魚肉，在經(jīng)歷了短暫的延滯期之后就進入了對數(shù)生長期，嗜溫菌始終占據(jù)優(yōu)勢地位。我國國標(GB18406.4 －2001)規(guī)定的水產(chǎn)品中細菌總數(shù)應≤106個/g(cfu/g)，以菌落總數(shù)106cfu/g 為貨架期終點，0、4、15 和25℃下貯藏的大目金槍魚貨架期分別為14 d、6 d、24 h 和12 h。

新鮮金槍魚肉中的菌落總數(shù)表明了魚類從熱帶和亞熱帶海域中捕撈時嗜溫菌是占主導地位的，這一結(jié)果與Shewan［15］發(fā)現(xiàn)的從印度洋溫水海域中捕獲的魚類中嗜溫性的革蘭氏陽性菌占優(yōu)勢是一致的。本研究中，4 個貯藏溫度下魚肉貨架期的顯著差異表明了低溫能有效抑制微生物的生長，但并不能使微生物死亡，在適應了低溫條件后微生物的增長速度逐漸加快，這一結(jié)果與李學英［16］研究的大黃魚菌落總數(shù)變化結(jié)果相似。

圖3 大目金槍魚在0℃、4℃下貯藏的菌落總數(shù)變化Fig.3 Changes of total viable count in big eye tuna during storage at 0℃、4℃

圖4 大目金槍魚在15℃、25℃下貯藏的菌落總數(shù)變化Fig.4 Changes of total viable count in big eye tuna during storage at 15℃、25℃

2.3 感官評定分析

大目金槍魚在0、4、15 和25℃下貯藏期間的感官評定結(jié)果如圖5 和圖6 所示。溫度對感官評定結(jié)果的影響顯著(P＜0.5)，在0、4、15 和25℃下貯藏的大目金槍魚被感官拒絕的時間分別為10 d、5 d、36 h和12 h。魚肉被感官評定員判定為不可食用的時候，0℃和4℃魚肉中的菌落總數(shù)并未超過我國海水魚類衛(wèi)生標準規(guī)定的二級鮮度(106cfu/g)指標，魚肉這么早的被感官評論員拒絕說明不僅菌落總數(shù)對魚肉的貨架期有影響，其他的一些因素包括菌的種類、魚肉自溶、生化特性以及貯藏條件也對魚肉貨架期有影響。圖7 所示為不同貯藏溫度下大目金槍魚肉感官評定結(jié)果與K 值含量之間的關(guān)系。感官評定得分隨著K 值的增長而降低，兩者之間有良好的線性關(guān)系，R2=0.935 9。這一結(jié)果與Neijib Guizani［8］的研究結(jié)果相似，Neijib Guizani 研究發(fā)現(xiàn)黃鰭金槍魚在0、8 和20℃貯藏過程中K 值變化與感官評定之間存在一定的線性關(guān)系。

圖5 大目金槍魚在0℃、4℃下貯藏過程中的感官評定分析Fig.5 Sensory evaluation of big eye tuna during storage at 0，4℃

圖6 大目金槍魚在15℃、25℃下貯藏過程中的感官評定分析Fig.6 Sensory evaluation of big eye tuna during storage at 15，25℃

圖7 不同溫度下魚肉感官評定結(jié)果與K 值的關(guān)系Fig.7 Relationship between sensory scores of big eye tuna and K values at different temperatures

2.4 組胺含量變化

大目金槍魚背部肌肉在0、4、15 和25℃下貯藏期間的組胺含量變化如圖8 和圖9 所示。0℃貯藏條件下，金槍魚肉在第12 天時開始產(chǎn)生組胺，16 d 后組胺含量為9.8 mg/100 g。4℃條件下，魚肉在貯藏初期也未檢測到組胺，在貯藏5d 之后組胺開始產(chǎn)生，第8 天時組胺含量達到17.2 mg/100 g。大目金槍魚背部肌肉在15℃貯藏條件下組胺含量增長較快，24 h后魚肉中組胺含量為12.1 mg/100 g，72 h 之后達到88.6 mg/100 g。25℃條件下魚肉中組胺的增長速度最快，經(jīng)過36 h 貯藏之后，魚肉中組胺含量達到

23 2.5 mg/100 g。

以國標(GB2733 －2005)規(guī)定的海水魚組胺含量少于30 mg/100 g 為判定指標，大目金槍魚背部肌肉在15℃和25℃條件下貯藏的貨架期分別為48 h 和24 h;而0℃和4℃條件下組胺含量到貯藏期結(jié)束都沒有超標。這一顯著性差別與溫度和微生物的生長有密切的關(guān)系，能夠產(chǎn)生組胺的微生物大多為嗜溫菌，在0℃和4℃下這些微生物的生長受到抑制，組胺脫羧酶的活性降低，產(chǎn)組胺的能力下降，組胺增長緩慢;Okuzumi［17］研究發(fā)現(xiàn)能夠產(chǎn)生組胺的微生物如Proteus morganii 等在20 ～30℃下增長速度非常快，因此產(chǎn)組胺微生物在15℃和25℃下快速繁殖是大目金槍魚組胺增長迅速的主要原因。本實驗結(jié)果與Lopez-Sabater［18］的研究結(jié)果相似，Lopez-Sabater 研究發(fā)現(xiàn)在20℃條件下，藍鰭金槍魚肉組胺增長速度較快，保質(zhì)期僅僅為1 d，在8℃條件下魚肉的保質(zhì)期為4 d。而Nejib Guizani［8］研究發(fā)現(xiàn)黃鰭金槍魚在0℃貯藏條件下魚肉中的組胺含量逐漸降低，經(jīng)過17d 的貯藏期之后，組胺從初始的2.78 mg/100 g 降為0.61 mg/100 g。Sato［19］等認為組胺的產(chǎn)生不僅僅與產(chǎn)組胺菌有關(guān)，還跟組胺降解菌有關(guān)，在5℃條件下魚肉中組胺在達到最高濃度后會逐漸降低直到消失。而本實驗中不同溫度下魚肉中的組胺含量均未出現(xiàn)降低趨勢，這可能與魚肉中微生物和實驗條件的差異有關(guān)。

圖8 大目金槍魚在0℃、4℃下貯藏的組胺含量變化Fig.8 Changes in content of histamine in big eye tuna during storage at 0℃、4℃

圖9 大目金槍魚在15℃、25℃下貯藏的組胺含量變化Fig.9 Changes in content of histamine in big eye tuna during storage at 15℃、25℃

3 結(jié)論

實驗結(jié)果表明，貯藏溫度對大目金槍魚背部肌肉的鮮度變化影響顯著，綜合K 值、菌落總數(shù)等生化指標和感官評定結(jié)果，大目金槍魚背部肌肉在0、4、15和25℃下貯藏的貨架期分別為10 d、5 d、24 h 和12 h。感官評定得分隨著K 值的增長而降低，兩者變化之間具有良好的線性關(guān)系。溫度對大目金槍魚背部肌肉組胺變化影響較大，低溫能抑制產(chǎn)組胺菌的生長，降低組胺脫羧酶的活性，魚肉組胺含量增長緩慢，而15℃和25℃下魚肉中組胺增長迅速，分別在第48 h 和24 h 超過30 mg/100 g。以上研究表明低溫貯藏能減緩鮮度降低的速率，延長大目金槍魚的貨架期，同時也能抑制組胺的增長，防止組胺中毒事件的發(fā)生。

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