姚元鋒，趙廣榮

(天津大學化工學院制藥工程系，天津，300072)

L-酪氨酸(L-tyrosine，Tyr)是一種重要的營養(yǎng)必需氨基酸，對人和動物的生長發(fā)育和新陳代謝起重要的作用，常作為營養(yǎng)補充劑以及L-多巴、對羥基肉桂酸、對羥基苯乙烯等醫(yī)藥化工產品的制備原料被廣泛應用在食品、飼料、醫(yī)藥和化工等行業(yè)。傳統(tǒng)的L-酪氨酸主要應用蛋白質水解法和酶法［1］來進行生產。但它們由于材料來源有限、反應過程中酶活性和穩(wěn)定性差［2－3］、工藝繁瑣、產品成分復雜等缺點而受到了嚴重制約。近年來隨著代謝工程和先進生物技術迅猛發(fā)展，重新合理設計和優(yōu)化微生物的代謝途徑來更好地實現(xiàn)L-酪氨酸的發(fā)酵生產逐漸成為研究熱點。

1 L-酪氨酸生物合成途徑

L-酪氨酸生物合成途徑屬于芳香族氨基酸合成途徑，只能由植物和微生物合成。目前L-酪氨酸的合成途徑和調控機制以大腸桿菌(Escherichia coli)和谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)中研究得最多并闡釋得最為清楚［4－5］。

如圖1 所示，L-酪氨酸合成的前體物4-磷酸赤蘚糖(Erythrose-4-phosphate，E4P)和磷酸烯醇式丙酮酸(Phophoenol pyruvate，PEP)在DAHP 合成酶(DS)的催化下縮合生成3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)，該反應也是L-酪氨酸生物合成途徑的第一個限速步驟。在大腸桿菌中DAHP 合成酶包含AroG、AroF 和AroH 3 個同工酶，其表達和酶活分別受產物L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸的反饋阻遏和反饋抑制。從DAHP 到分支酸的7 步反應是所有芳香氨基酸合成的共同途徑。分支酸是芳香族氨基酸合成途徑的分支點，一個分支途徑用于合成L-色氨酸，另一部分則在分支酸變位酶(chorism mutase，CM)和預苯酸脫水酶(prephenate dehydratase，PD)雙功能酶TyrA 的作用下生成對羥基苯丙酮酸(4HPP)，后者通過與L-谷氨酸的轉氨作用生成L-酪氨酸，而TyrA 的表達和酶活同樣受到產物L-酪氨酸的反饋阻遏和反饋抑制。

2 L-酪氨酸代謝途徑改造

代謝工程作為一種修飾和優(yōu)化微生物代謝網絡與表達調控網絡的強有力技術平臺，在優(yōu)化L-酪氨酸代謝途徑，改善L-酪氨酸生產特性等方面得到廣泛的應用并取得了很大成績(如表1 所示)。而考慮到L-酪氨酸代謝途徑和調控網絡的特點，L-酪氨酸代謝途徑的改造主要集中在以下幾方面。

2.1 解除途徑調控

L-酪氨酸合成途徑中關鍵酶的酶活或表達強度受到代謝終產物L-酪氨酸強烈的反饋抑制或阻遏，并在轉錄水平受到調控蛋白TyrR 的調節(jié)(如圖1 所示)，使L-酪氨酸的積累受到嚴重制約。因此解除關鍵酶的反饋抑制(feedback-resistant，fbr)并解除轉錄負調控，有望提高微生物合成L-酪氨酸的能力。

圖1 酪氨酸生物合成途徑及優(yōu)化策略Fig．1 Biosynthesis pathway of tyrosine and its optimize strategy in E. coli

表1 代謝工程優(yōu)化微生物生產酪氨酸Table 1 Metabolic engineering to optimize the production of Tyrosine

2.1.1 解除反饋抑制

在芳香族氨基酸合成途徑中，DAHP 合酶DS 和雙功能酶TyrA 受終產物L-酪氨酸的調控最為強烈。DS 酶的147 －149 位以及鄰近的氨基酸殘基和DS 的反饋抑制有關。Weaver 等［16］也發(fā)現(xiàn)AroF 蛋白的Pro-148-Leu 突變對L-酪氨酸不敏感。而Kikuchi等［17］的研究表明AroG 蛋白的Asp-146-Asn 突變可以解除苯丙氨酸的反饋抑制作用，而Pro-150-Leu 的突變則不僅不受L-苯丙氨酸的抑制，反而還可以被L-苯丙氨酸增強催化活性。同樣Lutke 等［18］也發(fā)現(xiàn)TyrA 蛋白分支酸變位酶結構域的Met-53-Ile 突變和預苯酸脫氫酶結構域的Ala-354-Val 突變可以完全解除其對L-酪氨酸的敏感性。Ikeda 等［14］等克隆抗反饋抑制的DAHP 合酶DS II 和分支酸變位酶CM 并構建過表達質粒，轉化生產色氨酸的谷氨酸棒桿菌KY10865 后，通過分批發(fā)酵獲得了26 g/L 的L-酪氨酸產量。

2.1.2 缺失調控蛋白TyrR

大腸桿菌的tyrR基因編碼芳香氨基酸生物合成和運輸途徑中的一種全局性調控蛋白，該蛋白質控制著包括自身編碼基因tyrR在內的涉及苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸合成與運輸的8 個轉錄單位的轉錄。當有酪氨酸存在時，TyrR 蛋白抑制包括tyrB、aroL、aroF、tyrA在內的等基因的轉錄［19］。因此TyrR 的敲除可以解除其對酪氨酸代謝途徑的阻遏，從而促進L-酪氨酸的合成。Lutke 等［10］在過表達aroGfbr和tyrAfbr的大腸桿菌工程菌株中敲除tyrR，20 h 內在搖瓶培養(yǎng)可以合成346 mg/L 的L-酪氨酸。而在3L 的發(fā)酵罐中，通過分批補料發(fā)酵則可以獲得3.8 g/L 的L-酪氨酸。Munoz 等［20］則發(fā)現(xiàn)在PTS+和PTS－的大腸桿菌菌株中，tyrR的敲除分別提高了1.6 倍和1.9倍的酪氨酸產率。

2.2 增加前體供應

在芳香族氨基酸合成途徑中，PEP 和E4P 是2個重要的限制性底物，它們的供應量決定著中心代謝流的碳源能否有效地導向DAHP 的合成，從而為芳香族氨基酸的合成提供充足的前體物質。

2.2.1 提高PEP 合成

PEP 來自于糖酵解途徑，是一個多酶競爭性底物。其中葡萄糖轉運系統(tǒng)(PTS)消耗利用約50%的PEP，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEP carboxylase，PEPC)和丙酮酸激酶(Pyruvate kinase，PYK)消耗約32%的PEP，大約只有3%的PEP 用于芳香氨基酸的合成［21］。因此改造PTS 系統(tǒng)和缺失ppc及pyk是提高細胞內PEP 含量的有效手段之一(如圖1 所示)。Munoz 等［20］通過敲除酪氨酸生產菌株W3110-TIR 中的ptsI和ptsH來缺失PTS 系統(tǒng)，使酪氨酸的產率提高了3 倍達到33 mg/(g·h)。Gosset 等［22］在大腸桿菌中敲除pykA和pykF后，芳香氨基酸合成途徑的碳代謝流增加了3.4 倍，繼續(xù)缺失PTS 系統(tǒng)后則增加了5.8 倍。

加強PEP 合成途徑關鍵酶的表達也可以提高PEP 的合成。磷酸烯醇式丙酮酸合酶(PEP synthase，PpsA)催化丙酮酸到PEP 的轉化。Patnaik 等［23］等研究了過表達ppsA對DAHP 合成的影響。在大腸桿菌中過表達aroG和tktA的基礎上，過表達PEP 合酶基因ppsA，細胞內的DAHP 含量提高了兩倍，并接近最大理論產量。

增強PEP 合成的另一種策略是缺失全局碳調控因子csrA［24］(如圖2 所示)。貯碳因子(Carbon storage regulator ，CsrA)是一種從整體代謝水平上參與調控的RNA 結合蛋白，對負責分解PEP 的丙酮酸激酶pyk正調控，對負責PEP 生成的PEP 羧激酶(PckA)以及PEP 合成酶(PpsA)負調控。因此csrA的敲除可以解除其對這些有利于PEP 合成的酶的調控，從而提高PEP 水平［25－27］。

2.2.2 提高細胞內E4P 含量

E4P 是細胞內磷酸戊糖途徑的代謝中間產物。因此過表達戊糖磷酸途徑中的一些關鍵酶，如:轉酮酶(Transketolase，TktA)［28］和轉醛酶(Transaldolase，TAL)［29］等被用來優(yōu)化L-酪氨酸代謝途徑(如圖2 所示)。Lutke 等［10］在L-酪氨酸生產菌株大腸桿菌T1的基礎上單獨過表達tktA，提高產量10%，單獨過表達ppsA則可以使L-酪氨酸產量提高35%，而ppsA和tktA同時過表達則使酪氨酸的產量提高了80%，達到620 mg/L。Ikeda 等［11］在谷氨酸棒桿菌中報道了類似的結果，通過過表達棒桿菌的tktA基因，使酪氨酸產量提高了20%。

2.3 阻斷競爭途徑

由酪氨酸合成途徑可以看出，苯丙氨酸和色氨酸合成途徑是其競爭途徑。阻斷這2 條競爭性途徑不僅可節(jié)約碳源，使代謝流更多的流向L-酪氨酸的合成，還可解除L-苯丙氨酸和L-色氨酸對合成途徑中DAHP 合成酶(DS)的反饋抑制，有利于酪氨酸的積累。Olson 等［6］通過敲除負責L-苯丙氨酸合成酶基因pheA及其調控基因pheL，將一株生產L-苯丙氨酸的大腸桿菌改造成L-酪氨酸生產菌株，42 h 內L-酪氨酸產量為0.18 g/L。

2.4 調節(jié)轉運系統(tǒng)

產物的轉運和胞外分泌涉及到細胞對外界環(huán)境的感應，對于優(yōu)化L-酪氨酸的代謝途徑也很重要。Ikeda 等［21］過敲除谷氨酸棒桿菌中的轉運蛋白基因aroP［30］，缺失了菌株芳香族氨基酸的轉運系統(tǒng)，使L-酪氨酸產量增加了30%，達到4.3 g/L。

3 L-酪氨酸代謝途徑全局優(yōu)化

傳統(tǒng)的代謝工程方法主要改變的是生物合成途徑中的關鍵的結構基因或調控基因，針對簡單的代謝途徑這是迅速而有效的。但是針對L-酪氨酸途徑這樣一個涉及多基因和多種調控的復雜途徑，往往只能達到局部途徑的最優(yōu)化，而不是細胞的全局最優(yōu)產量。因此從全局出發(fā)，綜合考察涉及基因水平，轉錄水平和翻譯水平對整個合成途徑優(yōu)化的影響是必須的?；诖?，一些創(chuàng)新而有效的代謝工程新方法已經越來越多的應用于L-酪氨酸代謝途徑的全局優(yōu)化。

3.1 模塊代謝工程優(yōu)化策略

Juminaga 等［8］人采用模塊化代謝工程(modular engineering)策略，將酪氨酸合成途徑和中心碳代謝途徑中的11 個關鍵基因，按照功能拆分成2 個較小的莽草酸合成模塊和酪氨酸合成模塊。莽草酸模塊包含ydiB、aroD、aroB、aroGfbr、ppsA和tktA等6 個基因，代表由葡萄糖合成莽草酸這一局部代謝途徑。L-酪氨酸模塊包含tyrB、tyrAfbr、aroC、aroA和aroL等5個基因，代表由莽草酸合成L-酪氨酸另一局部代謝途徑。然后分別對每個模塊進行包含啟動子、終止子、拷貝數、密碼子等在內的優(yōu)化，構建模塊文庫。然后通過2 個文庫的不同組合，以終產物L-酪氨酸作為監(jiān)測目標，進行模塊之間適配性的優(yōu)化。同時監(jiān)測如奎寧酸、脫奎寧酸和莽草酸等中間代謝產物來進行模塊內的微調。最終篩選得到由LacUV5 啟動子控制aroE-aroD-aroB組成模塊、由LtetO-1 啟動子控制aroGfbr-ppsA-tktA組成模塊，和由LacUV5 啟動子控制tyrB-tyrAfbr-aroC組成模塊、由Trc啟動子控制的aroAaroL組成模塊，組合為最優(yōu)。最優(yōu)菌株在24 h 內L-酪氨酸產量為2.6 g/L，達到理論產率的79%。對此菌株的模塊進一步分析發(fā)現(xiàn)aroB，aroE和aroL3 個基因是優(yōu)化此途徑的瓶頸，這是傳統(tǒng)代謝途徑優(yōu)化所沒有發(fā)現(xiàn)的。由此可見模塊化代謝工程不僅通過拆分簡化了途徑優(yōu)化的復雜性而且還有助于發(fā)現(xiàn)一些未知的改造靶基因。

3.2 全局轉錄工程優(yōu)化策略

代謝工程改造往往都是針對已知的代謝途徑和調控因子，而對很多不明確的靶基因和調控因子無能為力。全局轉錄裝置工程(global transcription machinery engineering ，gTME)［31］就是通過易錯PCR、DNA shuffling 等方法對σ 因子和各種轉錄因子等轉錄元件進行多輪改組突變修飾，從而系統(tǒng)改變細胞轉錄組并有效地提高細胞的抗逆性能以及目標產物的合成能力。Santos 等［12］利用gTME 的方法，將大腸桿菌中編碼σ70因子的rpoD基因和編碼RNA 聚合酶α亞基的rpoA基因通過易錯PCR 構建隨機突變文庫，并連接到低拷貝的表達載體上轉化野生型大腸桿菌，篩選到rpoA突變的大腸桿菌rpoA14 菌株L-酪氨酸產量達13.8 g/L。測序顯示rpoA14 菌株在RpoA 蛋白的α 亞基C 末端存在Val-257-Phe 和Leu-281-Pro 2 個突變位點。轉錄水平分析顯示，此rpoA的突變導致幾百個基因的上調和下調，這些基因大多與酸抗性調控因子evgA或者ppGpp 合酶relA有關。由此可以看出作為一種全新的代謝工程方法，gTME 是一種更加全局化的全細胞優(yōu)化方式，其在多基因和多調控方式控制的復雜代謝途徑優(yōu)化上有無可比擬的優(yōu)勢。

3.3 sRNAs 工程優(yōu)化策略

sRNAs(Small RNAs)是一類長度為幾十到幾百個核苷酸長度具有調控基因表達功能的非編碼雙鏈RNA［32］。在原核生物如大腸桿菌中，sRNA 主要是通過互補鏈結合或者與蛋白質相互作用在轉錄后水平對mRNA 的翻譯進行調控［33］。針對大腸桿菌L-酪氨酸的生物合成中負作用基因tyrR、csrA、ppc和pgi，Dokyun 等［13］合理設計并人工合成了這4 個基因的負調控sRNA，并用于篩選L-酪氨酸高產菌株。為了促進sRNA 和靶mRNA 雜交以及靶mRNA 的降解，在sRNA 中引入了一個MicC［34］的骨架，用于結合RNA 分子伴侶Hfp 蛋白［35］。將這4 個合成的sRNA隨機組合并構建了低拷貝表達載體，轉化14 種不同的大腸桿菌進行篩選。最終發(fā)現(xiàn)了tyrR、csrA表達被sRNA 抑制的S17-1 菌株的酪氨酸高產菌株，在高密度培養(yǎng)下可達到21.9 g/L 的L-酪氨酸。

4 展望

L-酪氨酸作為3 大芳香氨基酸之一，在應用規(guī)模上一直遠遠小于L-苯丙氨酸和L-色氨酸［4］。但隨著L-酪氨酸重要衍生物如L-多巴、黑色素、咖啡酸、丹參素等代謝途徑的揭示和深入研究，L-酪氨酸逐漸發(fā)揮出一個平臺型化合物的功能，而針對其代謝工程的研究也吸引了諸多研究者的關注。隨著越來越多衍生物代謝途徑及代謝調節(jié)機制的不斷深入研究，加之新的代謝工程優(yōu)化策略的開發(fā)和完善，相信L-酪氨酸的發(fā)酵生產和工業(yè)應用必將打開一個新局面。

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