劉自平，李靜，吳春霞，張雨，李海濤，戴一

(安徽新華學(xué)院 藥學(xué)院，安徽 合肥，230088)

5-羥甲基糠醛［1］(HMF)是天然蜂蜜與加工蜂蜜中的還原糖經(jīng)加熱、脫水生成的一種黃色、具有難聞氣味的有毒物質(zhì)。在酸性條件下［2］，蜂蜜中的氨基化合物與葡萄糖發(fā)生Mailard 反應(yīng)或者蜂蜜中的還原糖發(fā)生脫水反應(yīng)，生成HMF。HMF 的存在不僅會(huì)導(dǎo)致蜂蜜風(fēng)味的改變和顏色的加深，而且會(huì)影響到蜂蜜食用的安全性。此外，HMF 對(duì)眼睛、黏膜或皮膚有刺激性，攝入過(guò)多會(huì)引起中毒，甚至引發(fā)癌癥、造成動(dòng)物橫紋肌麻痹和內(nèi)臟損傷。因此，在國(guó)際貿(mào)易中HMF含量屬于強(qiáng)制性檢測(cè)指標(biāo)之一［3］，我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T18796 －2012 規(guī)定要求每千克蜂蜜中HMF 的含量應(yīng)小于40 mg。目前蜂蜜中HMF 的檢測(cè)主要采用分光光度法及高效液相色譜法［4－5］，但這2 種方法都需要在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成檢測(cè)，無(wú)法滿(mǎn)足現(xiàn)場(chǎng)快速測(cè)定的需要。隨著膠體金免疫技術(shù)的快速發(fā)展，其在食品現(xiàn)場(chǎng)快速篩查與檢測(cè)方面的應(yīng)用也越來(lái)越廣泛，但目前，并沒(méi)有利用膠體金免疫層析技術(shù)在快速檢測(cè)HMF 方面的應(yīng)用，因此，本研究利用膠體金標(biāo)記HMF的單克隆抗體，制成檢測(cè)試紙條，以滿(mǎn)足現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)蜂蜜中HMF 的要求。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

氯金酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);牛血清蛋白、羊抗鼠二抗(上海捷寧生物科技有限公司);抗HMF 單克隆抗體、牛血清白蛋白-HMF(BAS-HMF)(本實(shí)驗(yàn)室自制);檸檬酸三鈉(上海青析化工有限公司)，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

硝酸纖維素膜、樣品墊、吸水紙(均為美國(guó)Millipore)，臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司)，分光光度計(jì)(Beckman Du 公司)，磁力攪拌器(北京北科思拓儀器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 膠體金的制備

1.2.1.1 膠體金制備方法

參照文獻(xiàn)［6－7］，取硅化處理過(guò)的1 個(gè)250 mL 三角瓶，向其中加入100 mL 三蒸水及1 mL 1% 氯金酸，加熱至沸騰后，加入2.4 mL 1%檸檬酸三鈉，起初溶液顏色為黑色，接著變藍(lán)，最后變?yōu)榫萍t色，關(guān)掉電源，繼續(xù)磁力攪拌反應(yīng)5 min，冷卻即得膠體金。

1.2.1.2 膠體金顆粒大小的制備

A 液(80 mL):1%氯化金，l mL;雙重蒸餾水，79 mL;B 液(20 mL):1%檸檬酸鈉，4 mL;1%單寧酸，0. l mL;雙重蒸餾水，15.8 mL;25 mmol/L K2CO3，0.1 mL;將上述A 液加熱到60℃，然后將B 液快速加入到A 液中，繼續(xù)攪拌，在極短的時(shí)間內(nèi)加熱到煮沸(大約10 min)，顏色由黑→藍(lán)→酒紅色。pH 值調(diào)到所需要求。上述用量合成的膠體金顆粒為10nm，根據(jù)所加入鞣酸量的不同，可合成3 ～17 nm 顆粒大小的膠體金，在鞣酸-檸檬酸鈉還原法中，檸檬酸鈉是主要的還原劑;而鞣酸則具有雙重作用，既起還原作用，也有保護(hù)作用，它控制著“晶核”的形成過(guò)程，故可改變鞣酸的用量來(lái)制備不同顆粒的膠體金。按照文獻(xiàn)［7］，用分光光度計(jì)對(duì)膠體金在可見(jiàn)光范圍(400 ～600 nm)進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)其主峰寬度較小，表明制備膠體金顆粒較均勻;其最大波長(zhǎng)為521 nm，表明其顆粒度為20 nm。用20 nm 膠體金顆粒標(biāo)記抗HMF 特異性單克隆抗體。

1.2.1.3 完全抗原(BAS-HMF)制備

用琥珀酸酐將半抗原HMF 和載體蛋白BAS 偶聯(lián)，形成完全抗原BAS-HMF。

1.2.1.4 抗HMF 單克隆抗體的制備

取BAS-HMF 稀釋于生理鹽水中共0.3 mL，加等量弗氏完全佐劑充分乳化后，腹腔注射于小鼠0.2 mL/只。14d 后，取75 μgBAS-MHS-HMF 交聯(lián)物，加弗氏不完全佐劑充分乳化后腹腔注射上述小鼠后，取免疫小鼠尾靜脈進(jìn)行效價(jià)測(cè)定，同時(shí)做小分子的競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)，效價(jià)達(dá)到1∶32 萬(wàn)，血清競(jìng)爭(zhēng)達(dá)到1 000 ng，即可小鼠尾靜脈注射加強(qiáng)免疫，3d 后常規(guī)融合，包被HMF-TG 交聯(lián)物(1 mg/L)以間接ELISA 方法進(jìn)行篩選，取陽(yáng)性孔且有競(jìng)爭(zhēng)的克隆孔以有限稀釋法進(jìn)行克隆化。陽(yáng)性率達(dá)到100%后，擴(kuò)大培養(yǎng)收集細(xì)胞注射小鼠腹腔7d 后收集腹水。

1.2.2 膠體金-抗HMF 特異性單克隆抗體的制備

取50 mL 膠體金，用K2CO3調(diào)pH 值至8.0 左右，加10 μL 抗HMF 單抗的腹水，室溫振蕩30 min，加入一定量的BSA 使其終含量為1%，室溫振蕩1 h。離心(12 000 r/min，4℃)20 min，棄去上清液，用50 g/L 蔗糖、10 g/L BSA 和200 mg/L 疊氮鈉的PBS 重懸沉淀，即得腹水標(biāo)記膠體金的復(fù)合物。制備好的復(fù)合物用0.22 μm 濾膜過(guò)濾后4℃下保存。

1.2.3 膠體金單克隆抗體免疫層析試紙條的組裝

將牛血清蛋白-HMF 交聯(lián)物和羊抗小鼠IgG 分別畫(huà)線(xiàn)于硝酸纖維膜上，作為樣品檢驗(yàn)區(qū)(T 線(xiàn))和質(zhì)控區(qū)(C 線(xiàn))，在玻璃纖維膜上噴涂有膠體金標(biāo)記的HMF 單抗(金標(biāo)墊)。(見(jiàn)圖1)

圖1 膠體金免疫層析試紙條結(jié)構(gòu)圖Fig. 1 Chart of colloidal gold immunoch romatographic strip

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品的檢測(cè)及其結(jié)果的判斷

檢測(cè)時(shí)，將150 μL 蜂蜜樣品滴加于試紙條的樣品孔中，受毛細(xì)作用力向金標(biāo)墊層析，隨后金標(biāo)墊上的膠體金標(biāo)記物復(fù)溶于溶液中并隨溶液一起向吸水紙?zhí)幰苿?dòng)，經(jīng)過(guò)T、C 線(xiàn)時(shí)先后與其包被的抗原抗體發(fā)生抗原抗體反應(yīng)。結(jié)果當(dāng)樣品中HMF 的含量 =39.5 mg/kg，T 線(xiàn)顯示紫紅色條帶，與C 線(xiàn)相比顏色較淺，即樣品中HMF 的含量＜40 mg/kg，則過(guò)量的膠體金標(biāo)記物與T 線(xiàn)上蛋白特異性結(jié)合形成紫紅色條帶，為陰性;當(dāng)樣品中HMF 含量= 40 mg/kg，則T 線(xiàn)不顯色，即樣品中HMF 含量≥40 mg/kg，由于金標(biāo)抗體先與樣品中的HMF 結(jié)合，使得金標(biāo)記物不能和T線(xiàn)上蛋白結(jié)合，因而呈現(xiàn)無(wú)色，為陽(yáng)性。無(wú)論蜂蜜中HMF 的含量是多少，一條紫紅色條帶都會(huì)出現(xiàn)在質(zhì)控區(qū)內(nèi)(C)。質(zhì)控區(qū)(C)所顯現(xiàn)的紫紅色條帶是判定是否有足夠的蜂蜜樣品，層析過(guò)程是否正常的標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)也是作為試劑的內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)。所以當(dāng)C 線(xiàn)不顯色時(shí)說(shuō)明檢測(cè)結(jié)果無(wú)效(見(jiàn)圖2)。由于個(gè)人對(duì)色彩的敏感度不同，通過(guò)本試紙條檢測(cè)出的蜂蜜中HMF 含量存在±0.5 mg/kg 誤差。

圖2 試紙條結(jié)果判定Fig.2 Test results

2.2 試紙條檢測(cè)

2.2.1 試紙條特異性測(cè)定

由于在制備檢測(cè)試紙過(guò)程中，T 線(xiàn)位置使用HMF-BSA 作為抗原，如果制備的HMF 單克隆抗體與BSA 有交叉反應(yīng)，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果，因此本研究采用間接酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA 法)，將HMF-BSA 和BSA 分別包被酶標(biāo)板，封閉后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗HMF 單克隆抗體，洗滌后以TMB/H2O2顯色。結(jié)果顯示，抗HMF 單克隆抗體可以識(shí)別羥甲基糠醛-BSA，并且與BSA 沒(méi)有任何的交叉反應(yīng)。將HMF，乙醇，葡萄糖，糠醛等分別與同種天然蜂蜜混合配制成50 ～100 mg/kg 濃度的溶液進(jìn)行檢測(cè)，除羥甲基糠醛在試紙條上不顯紫紅色，呈陽(yáng)性外，其余都呈陰性。說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)研究的羥甲基糠醛檢測(cè)條對(duì)羥甲基糠醛具有特異性。

2.2.2 檢測(cè)范圍

本試紙條的檢測(cè)范圍設(shè)定為40 mg/kg。當(dāng)蜂蜜中的HMF 中的含量≥40 mg/kg 時(shí)，檢測(cè)線(xiàn)(T 線(xiàn))位置不出現(xiàn)紫紅色條帶呈陽(yáng)性，當(dāng)蜂蜜中的HMF 中的含量＜40 mg/kg 時(shí)，檢測(cè)線(xiàn)(T 線(xiàn))位置出現(xiàn)紫紅色條帶呈陰性。

2.2.3 準(zhǔn)確性

用該試紙條對(duì)20 份蜂蜜中HMF 進(jìn)行了檢測(cè)并與分光光度法及液相色譜法檢測(cè)結(jié)果作比較，檢測(cè)試劑以40 mg/kg 為判定極限，沒(méi)有出現(xiàn)假陽(yáng)性及假陰性，檢測(cè)結(jié)果與分光光度法及液相色譜法結(jié)果完全相符。

2.2.4 靈敏度

將1 g/kg 的標(biāo)準(zhǔn)品HMF 母液(1 gHMF 溶于1 kg 丙酮)用磷酸緩沖液系列稀釋成38.5、39.0、39.5、40.0、40.5、41.0、41.5 mg/kg，分別向4 個(gè)試紙條樣品墊上加入150 μL 上述稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在另一個(gè)試紙條的樣品墊上加入150 μL 磷酸緩沖液做陰性對(duì)照，5 min 后觀察T、C 線(xiàn)的顏色，重復(fù)5 次，結(jié)果如表1 所示。當(dāng)加入不含HMF 或HMF 質(zhì)量濃度＜40 mg/kg 時(shí)，T 線(xiàn)的顏色與C 線(xiàn)相近或稍淺;當(dāng)HMF的質(zhì)量濃度≥40 mg/kg 時(shí)，T 線(xiàn)基本消失。由此可見(jiàn)，HMF 的質(zhì)量濃度＜40 mg/kg 時(shí)，結(jié)果為陰性;HMF 的質(zhì)量濃度≥40 mg/kg 時(shí)，結(jié)果為陽(yáng)性。該試紙條的最低檢測(cè)線(xiàn)為HMF 的質(zhì)量濃度小于40 mg/kg。

表1 不同濃度HMF 標(biāo)準(zhǔn)品的測(cè)定結(jié)果Table 1 The test results of different HMF standard concentration

3 結(jié)論

本試紙條主要用于定性檢測(cè)蜂蜜中HMF 含量，其靈敏度和特異性較好。與ELISA 法的比對(duì)結(jié)果顯示，準(zhǔn)確度也較好。研究通過(guò)調(diào)節(jié)試紙條中PVC 板上的膠體金標(biāo)記的單克隆抗體的含量和檢測(cè)線(xiàn)(T線(xiàn))位置的HMF-BSA 抗原的量，將免疫層析試紙條的檢測(cè)值范圍設(shè)定在40 mg/kg，HMF 中的含量≥40 mg/kg 時(shí)，檢測(cè)線(xiàn)(T 線(xiàn))位置不出現(xiàn)紫紅色條帶呈陽(yáng)性，當(dāng)蜂蜜中的HMF 中的含量＜40 mg/kg 時(shí)，檢測(cè)線(xiàn)(T 線(xiàn))位置出現(xiàn)紫紅色條帶呈陰性。利用膠體金免疫層析技術(shù)消費(fèi)者可以在購(gòu)買(mǎi)蜂蜜的現(xiàn)場(chǎng)對(duì)蜂蜜中的HMF 的含量進(jìn)行定性鑒別，從而鑒別蜂蜜的新鮮程度，是否摻假以及熱加工處理?xiàng)l件，并且膠體金層析技術(shù)的(GICA)靈敏度高，特異性強(qiáng)，穩(wěn)定性好，操作簡(jiǎn)便快速，分析結(jié)果準(zhǔn)確且可通過(guò)肉眼直接判定結(jié)果，適合消費(fèi)者購(gòu)買(mǎi)蜂蜜時(shí)現(xiàn)場(chǎng)鑒別蜂蜜質(zhì)量的優(yōu)劣。

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