陳艷，朱小清，方水琴，郭慧琴，劉箐

1(上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海，200093)

2(上?；墼派锟萍加邢薰?，上海，200437)

由腸出血性大腸埃希菌O157:H7 引起的腸道感染性疾病已經(jīng)成為全球關(guān)注的公共衛(wèi)生問(wèn)題。大腸桿菌O157:H7 感染能引起出血性結(jié)腸炎(HC)，闌尾炎和結(jié)腸穿孔等嚴(yán)重胃腸道并發(fā)癥［1］，嚴(yán)重的可引起血栓性血小板紫癜(TTP)和溶血性尿路綜合癥(HUS)等全身性并發(fā)癥，其中3% ～5%的HUS 病人死亡，約有12% 的HU S 病人有嚴(yán)重的后遺癥［2］。而且人的感染劑量極低，攝入50 ～100 個(gè)活菌就可引起發(fā)病［3］。

目前腸出血性大腸埃希菌O157:H7 的常用檢測(cè)方法包括傳統(tǒng)平板分離培養(yǎng)和生理生化鑒別法、ELISA 法、PCR 法、熒光定量PCR 法等［4－6］。生化方法耗時(shí)耗力，而且容易漏檢自然變異株。血清學(xué)方法抗體依賴(lài)國(guó)外進(jìn)口檢測(cè)成本太高，且O157:H7 抗血清與很多細(xì)菌有交叉凝集現(xiàn)象［4］。本實(shí)驗(yàn)將抗原抗體反應(yīng)高特異性和PCR 反應(yīng)高敏感性結(jié)合起來(lái)，首先免疫富集細(xì)菌，之后直接進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，省略了核酸提取過(guò)程，所有反應(yīng)在同一PCR 管里進(jìn)行，操作簡(jiǎn)便，大大提高了檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確性，同時(shí)降低了檢測(cè)成本，是一種非常實(shí)用的腸出血性大腸桿菌O157:H7 快速檢測(cè)技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株

大腸桿菌O157:H7 ATCC 82346、金黃色葡萄球菌ATCC 27660、鼠氏傷寒沙門(mén)氏菌ATCC 22956、腸炎沙門(mén)氏菌ATCC 13076、單增李斯特菌ATCC 43251、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌ATCC 23715、福氏志賀氏菌ATCC 12022、宋內(nèi)氏志賀氏菌ATCC 25931、痢疾志賀氏菌ATCC 51329 、乙型溶血性鏈球菌ATCC 10373、阪崎腸桿菌ATCC 29004，副溶血性弧菌ATCC 17802 均為本公司保藏的標(biāo)準(zhǔn)菌株。

1.1.2 試劑

抗體:腸出血性大腸桿菌O157:H7 單克隆抗體(3 mg/mL)由本公司自主制備并純化，單克隆抗體雜交瘤號(hào)是EC-Mab-D3;羊抗兔HRP-TgG，購(gòu)買(mǎi)自上海勵(lì)瑞生物科技有限公司;牛血清白蛋白，購(gòu)買(mǎi)自亞科生物科技有限公司。

大腸桿菌O157:H7 的ELISA 試劑盒為本公司自主生產(chǎn)。

培養(yǎng)基:普通營(yíng)養(yǎng)肉湯(NB)等培養(yǎng)基購(gòu)買(mǎi)自國(guó)藥集團(tuán)。

分子生物學(xué)試劑:10 × PCR Buffer、dNTPs、TaqDNA 聚合酶等分子生物學(xué)試劑，購(gòu)買(mǎi)自寶生物科技有限公司;rfbF 基因引物由生工合成。

無(wú)水Na2HPO4，無(wú)水KH2PO4，NaCl 等化學(xué)試劑，購(gòu)買(mǎi)自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng)

腸出血性大腸桿菌O157:H7 標(biāo)準(zhǔn)菌株和對(duì)照菌株標(biāo)準(zhǔn)菌株分別在普通營(yíng)養(yǎng)肉湯(副溶血性弧菌培養(yǎng)基需加入3%的NaCl，乙型溶血性鏈球菌培養(yǎng)基需加入7%的全血)中37 ℃搖床(150 r/min)培養(yǎng)18 ～24 h。通過(guò)平板計(jì)數(shù)法得到菌液的濃度(CFU/mL)。

1.2.2 免疫捕獲方法的構(gòu)建

1.2.2.1 抗體包被PCR 管制備IC-PCR 管

用包被液稀釋出血性大腸桿菌O157:H7 單克隆抗體(3 mg/mL)，使得單抗的濃度為10 μg/mL，將稀釋好的單克隆抗體每管50 μL 加入PCR 管中，4℃過(guò)夜包被。免疫捕獲出血性大腸桿菌O157:H7。

4℃過(guò)夜包被后取出并將PCR 管中的液體扣出，再加入PBST(0.1M，pH7.4)洗滌，洗滌時(shí)輕微震蕩，重復(fù)洗滌2 ～3 次，洗滌完成后盡量叩干管內(nèi)殘存洗滌液。加入過(guò)夜培養(yǎng)的大腸桿菌O157:H7(普通營(yíng)養(yǎng)肉湯為陰性對(duì)照)，37℃孵育2h，取出，用PBST(0.1M，pH7.4)洗滌，重復(fù)洗滌2 ～3 次，洗滌完成后盡量叩干管內(nèi)殘存洗滌液。

1.2.2.2 PCR 擴(kuò)增大腸桿菌O157:H7 的rfbF 基因［7］

在1.2.2.1 步驟得到的PCR 管中加入PCR 體系:10 ×PCR Buffer 5 μL;dNTP(2.5 mmol/L)2 μL;TaqDNA 聚合酶(5U/L)1 μL;正向引物(10 μmol/L)2 μL，引物5’-att gcg ctg aag cct ttg-3’;反向引物(10 μmol/L)2 μL，引物5’-cga gta cat tgg cat cgt g-3’;加入ddH2O 雙蒸水補(bǔ)足至50 μL(反應(yīng)體系為50 μL)。

PCR 的反應(yīng)程序參數(shù)為:95℃預(yù)變性5 min，用于裂解菌體;35 個(gè)循環(huán)(95℃變性15 s;55℃退火30 s;72℃延伸1 min)，72℃再延伸5 min，4℃保溫;擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳來(lái)檢測(cè)目標(biāo)條帶并且紫外投射成像分析。

1.2.3 免疫捕獲PCR 檢測(cè)出血性大腸桿菌O157:H7 特異性

將目的菌株大腸桿菌O157:H7 和對(duì)照菌株金黃色葡萄球菌、鼠氏傷寒沙門(mén)氏菌、腸炎沙門(mén)氏菌、單增李斯特菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、福氏志賀氏菌、宋內(nèi)氏志賀氏菌、痢疾志賀氏菌、乙型溶血性鏈球菌、阪崎腸桿菌培養(yǎng)過(guò)夜，然后在實(shí)驗(yàn)步驟1.2.2.1 所制備的IC-PCR 管中加入各種培養(yǎng)過(guò)夜菌株的菌液，進(jìn)行免疫捕獲和PCR 擴(kuò)增檢測(cè)，步驟如1.2.2.2 和1.2.2.3。

1.2.4 免疫捕獲PCR、直接PCR、ELISA 檢測(cè)出血性大腸桿菌O157:H7 靈敏度比較

1.2.4.1 免疫捕獲PCR 檢測(cè)出血性大腸桿菌O157:H7 靈敏度

將培養(yǎng)過(guò)夜大腸桿菌O157:H7 平板計(jì)數(shù)，用生理鹽水將其稀釋至1.04 ×108～1.04 ×10 CFU/mL，各取200 μL 菌液加入制備好的IC-PCR 管中，進(jìn)行免疫捕獲和PCR 擴(kuò)增檢測(cè)。同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照。

1.2.4.2 直接PCR 檢測(cè)出血性大腸桿菌O157:H7靈敏度

腸出血性大腸桿菌O157:H7 標(biāo)準(zhǔn)菌株培養(yǎng)18 h后，稀釋菌液，菌液濃度梯度為:1.04 ×108～1.04 ×10 CFU/mL。每個(gè)梯度各取5 μL 菌液進(jìn)行直接PCR擴(kuò)增，生理鹽水設(shè)為陰性對(duì)照。

1.2.4.3 ELISA 檢測(cè)出血性大腸桿菌O157:H7 靈敏度

將腸出血性大腸桿菌O157:H7 多克隆抗體包被到ELISA 板上，4℃過(guò)夜，次日洗掉殘液，用PBST 洗3次拍干，用3%的的BSA 封閉(200 μL/孔)，37℃封閉1 h，用PBST 洗3 次，拍干，各個(gè)孔中加入過(guò)夜培養(yǎng)的稀釋梯度的大腸桿菌菌液(108～103CFU/mL，100 μL/孔)，以肉湯作為陰性對(duì)照，37℃孵育1 h，用PBST 洗3 次，然后各孔加入100 μL 的酶標(biāo)抗體，37℃溫育1 h，加入TMB 顯色液，，然后加入終止液，用酶標(biāo)儀450 nm 測(cè)定各孔吸光值，計(jì)算P/N 值，如果P/N≥2.1，則為陽(yáng)性。

1.2.5 免疫捕獲PCR 檢測(cè)出血性大腸桿菌O157:H7 食品模擬帶菌

采用的食樣為牛奶、酸奶、香腸、果汁、雞蛋、蛋糕。按照國(guó)標(biāo)GB/T4789.36 －2008《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸埃希氏菌O157:H7/NM 檢驗(yàn)》處理樣品，然后用不同濃度的出血性大腸桿菌O157:H7 純菌液人工污染樣品，，菌液的濃度依次為:1.04 ×108～1.04 × 102CFU/mL，最后分別進(jìn)行免疫捕獲和PCR 擴(kuò)增檢測(cè)，步驟如1.2.2.2 和1.2.2.3，設(shè)置空白對(duì)照。

2 結(jié)果分析

2.1 免疫捕獲PCR 方法特異性的驗(yàn)證

實(shí)驗(yàn)中采用了10 種非特異性菌株來(lái)驗(yàn)證此方法的特異性。從圖1 中看出，泳道1 和2 出血性大腸桿菌O157:H7 擴(kuò)增出499bp 左右的rfbF 基因片段，泳道9 宋內(nèi)氏志賀氏菌出現(xiàn)了非特異性擴(kuò)增條帶，其他對(duì)照菌株均無(wú)目的片段出現(xiàn)，可見(jiàn)該IC-PCR 方法對(duì)大腸桿菌O157:H7 有較好的特異性。

2.2 免疫捕獲PCR、ELISA、直接PCR 檢測(cè)靈敏度比較

圖1 IC-PCR 實(shí)驗(yàn)特異性驗(yàn)證Fig.1 Specific experiment of IC-PCR

表1 為ELISA 雙抗夾心法檢測(cè)大腸桿菌O157:H7 靈敏度結(jié)果，當(dāng)菌濃度低于105CFU/mL 時(shí)，P/N＜2.1，菌濃度達(dá)到105CFU/mL 時(shí)，P/N 值為2.67，大于2.1，所以ELISA 雙抗夾心法檢測(cè)大腸桿菌O157:H7 靈敏度達(dá)到105CFU/mL;圖2 為直接PCR檢測(cè)大腸桿菌O157:H7 的靈敏度檢測(cè)的結(jié)果，圖中泳道1 －4 號(hào)可見(jiàn)特異性目標(biāo)條帶出現(xiàn)，片段大小為499bp，并且可以看到亮度依次減弱。5 ～8 泳道和陰性對(duì)照未見(jiàn)特異性條帶。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，出血性大腸桿菌O157:H7 純菌液直接PCR 檢測(cè)的靈敏度為1.04 ×105CFU/mL，每反應(yīng)體系細(xì)菌數(shù)為520CFU。圖3 為免疫捕獲PCR 方法檢測(cè)大腸桿菌O157:H7的靈敏度，圖中泳道1 ～7 號(hào)可見(jiàn)特異性目標(biāo)條帶出現(xiàn)，片段大小為499bp，并且可以看到亮度依次減弱。8 泳道和陰性對(duì)照未見(jiàn)特異性條帶，由此推測(cè)ICPCR 檢測(cè)大腸桿菌O157:H7 純菌液檢測(cè)限的靈敏度可達(dá)到1.04 ×102CFU/mL，每反應(yīng)體系細(xì)菌數(shù)為20CFU。但在具體實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，有時(shí)候檢測(cè)限會(huì)達(dá)到1.04 ×104CFU/mL，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示免疫捕獲PCR 方法檢測(cè)大腸桿菌的靈敏度是ELISA 方法和直接PCR方法靈敏度的103倍。

多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)顯示IC-PCR 檢測(cè)靈敏度為102～104CFU/mL，多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)顯示，菌落計(jì)數(shù)的誤差、食品樣品的影響、操作的誤差等，是造成檢測(cè)靈敏度波動(dòng)的主要原因。

表1 ELISA 法檢測(cè)大腸桿菌O157:H7 靈敏度結(jié)果Table 1 Results of detection of Escherichia coli O157:H7 by ELISA

圖2 直接PCR 檢測(cè)靈敏度驗(yàn)證Fig.2 Sensitivity of the detection method using direct PCR

2.3 食品樣品模擬帶菌檢測(cè)

食品樣品采用了牛奶，酸奶，蛋糕，雞蛋，果汁，香腸。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4 所示，圖中A(1)、B(1)、C(1)、D(1)、E(1)、F(1)所示，可以看出直接PCR 檢測(cè)大腸桿菌O157:H7 食品樣本模擬帶菌的靈敏度可達(dá)到1.04 ×105～1.04 ×106CFU/mL，每反應(yīng)體系細(xì)菌數(shù)為5 ×102～5 ×103CFU。而圖中A(2)、B(2)、C(2)、D(2)、E(2)、F(2)所示，可以看出免疫捕捉PCR 檢測(cè)食品樣本模擬帶菌的靈敏度可達(dá)到1.04 ×103～1.04 ×104CFU/mL，每反應(yīng)體系細(xì)菌數(shù)為2 ×102～2 ×103CFU。大腸桿菌O157:H7 食品樣本模擬帶菌免疫捕獲PCR 比直接PCR 靈敏度至少提高了10 倍。

圖3 免疫捕獲PCR 檢測(cè)靈敏度驗(yàn)證Fig.3 Sensitivity of the detection method using IC-PCR

圖4 食品樣品模擬帶菌免疫捕獲PCR 實(shí)驗(yàn)研究Fig.4 Results of bacteria detection in food samples

3 討論

IC-PCR 技術(shù)集合了固相免疫反應(yīng)和PCR 技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，因而既提高了檢測(cè)特異性，又具有極高的靈敏度［8］。相比于直接PCR，IC-PCR 的PCR 管上包被特異性抗體，樣品中的出血性大腸桿菌O157:H7 被特異性抗體識(shí)別捕獲富集，之后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，致病菌經(jīng)過(guò)免疫學(xué)、分子生物學(xué)2 種檢測(cè)技術(shù)的雙重檢測(cè)，確保了檢測(cè)的準(zhǔn)確性，避免PCR 檢測(cè)中的假陽(yáng)性。另外該技術(shù)具有較高靈敏度，此方法省略了DNA 的提取過(guò)程，不僅方便省時(shí)，而且降低了DNA提取過(guò)程中的細(xì)菌損失，PCR 管壁上的單克隆抗體捕捉并富集了樣品中的出血性大腸桿菌O157:H7，間接提高了模板量，而在普通的PCR 實(shí)驗(yàn)中，沒(méi)有免疫富集的步驟，加入純菌液直接擴(kuò)增的模板量有限，因此檢測(cè)靈敏度會(huì)低于IC-PCR1-2 個(gè)數(shù)量級(jí)，因此IC-PCR 對(duì)于微量病原的檢測(cè)，具有一定的優(yōu)勢(shì)。

本實(shí)驗(yàn)中由于計(jì)數(shù)等存在實(shí)驗(yàn)操作問(wèn)題，有時(shí)靈敏度達(dá)到103CFU/mL。食樣檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，不同的食品模擬帶菌，檢測(cè)靈敏度可達(dá)到(103～104)CFU/mL，是直接PCR 的100 倍左右，不同樣品本身，對(duì)IC-PCR的靈敏度，具有一定的影響。另外實(shí)驗(yàn)采用10 種其他常見(jiàn)食源性致病菌作為對(duì)照菌株，檢測(cè)結(jié)果都為陰性，只有大腸桿菌為陽(yáng)性，證明了該檢測(cè)方法具有較高特異性。

綜上所述，IC-PCR 是一種廉價(jià)、高效、靈敏、快速的檢測(cè)技術(shù)，全部試驗(yàn)可在3 h 內(nèi)完成，致病菌經(jīng)過(guò)免疫識(shí)別、PCR 雙重檢測(cè)，確保了檢測(cè)結(jié)果的可靠性，適合食品安全監(jiān)管部門(mén)、食品企業(yè)實(shí)施血性大腸桿菌O157:H7 的快速檢測(cè)鑒定。

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