周海巖，劉龍，堵國成，3，陳堅(jiān)，3

1 (浙江工業(yè)大學(xué)生物工程研究所，浙江 杭州，310014)

2 (江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

3 (江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122)

噬菌體是一類感染細(xì)菌或放線菌的特殊的病毒［1］。噬菌體污染現(xiàn)象在工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)中極其普遍，輕則使發(fā)酵周期延長、發(fā)酵產(chǎn)量降低，重則造成倒罐，不僅浪費(fèi)時(shí)間、人力及物力，而且造成重大經(jīng)濟(jì)損失［2］。為解決噬菌體污染的問題，通常采用多方面綜合治理的措施，即控制生產(chǎn)環(huán)境質(zhì)量、化學(xué)防治及更換或輪流使用不同的生長菌株等方法。然而防治過程往往不夠徹底，這是由于噬菌體分布極其廣泛，凡是有細(xì)菌的地方就可能存在相應(yīng)的噬菌體，而且噬菌體體積較小，一般的過濾裝置難以將其完全除去?？故删w生產(chǎn)菌株的選育可以從根本上解決這一問題，從而保證發(fā)酵過程連續(xù)、穩(wěn)定地進(jìn)行。

在大腸桿菌WSH-Z06 (pAP-B03)發(fā)酵生產(chǎn)L-苯丙氨酸(L-Phe)過程中，L-Phe 產(chǎn)量下降、菌體裂解、發(fā)酵產(chǎn)物提取困難等異?，F(xiàn)象時(shí)有出現(xiàn)。經(jīng)雙層平板法檢測證實(shí)，導(dǎo)致發(fā)酵異常的主要原因是噬菌體污染。為克服此問題，本研究進(jìn)行了抗噬菌體并高產(chǎn)L-Phe 的菌株選育工作，考察了突變株在外源添加噬菌體條件下的發(fā)酵能力，并初步探討了突變株的抗噬菌體機(jī)制，為L-Phe 的工業(yè)化生產(chǎn)提供了1 株發(fā)酵性能優(yōu)良的菌株。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒和噬菌體

大腸桿菌WSH-Z06 和質(zhì)粒pAP-B03，由江南大學(xué)生物系統(tǒng)與生物加工實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保藏［3］。

噬菌體BP-1 分離于重組大腸桿菌WSH-Z06(pAP-B03)的L-Phe 異常發(fā)酵液，由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號(hào)為CCTCC NO:M 2010054。

1.2 培養(yǎng)基

TY 培養(yǎng)基［4］(g/L):蛋白胨10，酵母膏5，葡萄糖1，NaCl 5，pH 7.0，用于噬菌體增殖;單層固體培養(yǎng)基中加瓊脂2%，用于噬菌體的檢測;雙層固體培養(yǎng)基中上層加瓊脂0.8%，下層加2%，用于噬菌體的分離和檢測。

蛋白胨水［5］:蛋白胨10 g/L，蒸餾水配制，pH 7.0。

曙紅亞甲基藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基(EMB):蛋白胨10 g/L，乳糖10 g/L，KH2PO42 g/L，2%伊紅Y 溶液20 mL，0.65%美藍(lán)溶液10 mL，瓊脂2%，pH 7.1，用于大腸桿菌的鑒定。

種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基和流加培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)［3］。

1.3 噬菌體BP-1 的分離、純化

1.3.1 噬菌體增殖液的制備

取感染了噬菌體的發(fā)酵液5 mL，接入50 mL TY培養(yǎng)基中，同時(shí)加入1 mL 培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的WSH-Z06菌液，于37℃、200 r/min 培養(yǎng)12 ～16 h，即為噬菌體增殖液。

1.3.2 噬菌體裂解液的制備

取噬菌體增殖液500 μL，加入到4.5 mL 蛋白胨水中;37℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)4 ～6 h;60℃水浴中靜置10 min 以誘導(dǎo)噬菌體的釋放;37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)2 ～3 h;加入10% (v/v)三氯甲烷，處理30 min (幫助噬菌體裂解細(xì)菌);8 000 r/min 離心5 min;取上清液，用0.22 μm 的微孔濾膜過濾除菌;置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 噬菌體的分離、純化

采用雙層瓊脂平板法［6］。將適當(dāng)稀釋的噬菌體裂解液100 μL、培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的WSH-Z06 菌懸液100 μL 加入到保溫于45 ～50℃的TY 上層培養(yǎng)基中，振蕩混勻，立即倒入預(yù)先準(zhǔn)備好的下層培養(yǎng)基平板表面，凝固后置于37℃培養(yǎng)12 ～24 h，待平板上出現(xiàn)單個(gè)的噬菌斑，用接種針將噬菌體接入含有WSHZ06 的液體TY 中，37℃振蕩培養(yǎng)12 ～16 h;按照1.3.2 所述的方法制備噬菌體裂解液，重復(fù)以上步驟，直至出現(xiàn)形態(tài)、大小特征基本一致的噬菌斑。

1.3.4 噬菌體效價(jià)的測定

對(duì)雙層平板中出現(xiàn)的噬菌斑進(jìn)行計(jì)數(shù)，將結(jié)果代入以下公式以計(jì)算噬菌體的效價(jià):

式中，N為效價(jià)值(PFU/mL);Y為平均噬菌斑數(shù)/皿;V為取樣量(mL);X為稀釋倍數(shù)。

1.3.5 噬菌體的電鏡觀察

取一定量的異常發(fā)酵液或稀釋后的噬菌體裂解液，與等量的2%磷酸鎢鈉混合染色5 ～10 min 后滴1 小滴在覆有弗姆瓦(Formvar)的銅網(wǎng)膜上，用干燥濾紙從側(cè)面吸取染液，自然干燥后在透射電鏡(H －7000，日本Hitachi 公司)下觀察噬菌體的形態(tài)特征。

1.3.6 pH 和溫度對(duì)噬菌體活性的影響

pH 對(duì)噬菌體活性的影響:參照文獻(xiàn)［7］進(jìn)行。將噬菌體裂解液分別加入到pH 為3、4、5、6、7、8 和9的蛋白胨水中，25℃水浴中靜置2 h，以pH 7.0 的蛋白胨水逐級(jí)稀釋，按照1.3.4 所述的方法測定噬菌體的活性。

溫度對(duì)噬菌體活性的影響:參照文獻(xiàn)［7］進(jìn)行。將噬菌體裂解液分別置于50℃、60℃、70℃和80℃水浴中5 min、10 min、15 min 和20 min，之后立即置于冷水中至恒溫，以蛋白胨水逐級(jí)稀釋，按照1.3.4 所述的方法測定噬菌體的活性。

1.4 抗噬菌體、高產(chǎn)L-Phe 的重組大腸桿菌的篩選

1.4.1 WSH-Z06 的NTG 誘變處理

離心(10 000 r/min，5 min)、收集培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的WSH-Z06 菌體，用0.1 mol/L，pH 7.0 的磷酸鉀緩沖液洗滌1 ～2 次，然后懸浮菌體。按照表1 的體積組成配制成菌懸液為10% (v/v)、NTG 終濃度分別為0.2、0.4、0.6 和0.8 mg/mL 的體系;于37℃、200 r/min 的搖床上振蕩30 min;25℃、10 000 r/min 離心10 min，取菌體沉淀，用磷酸鉀緩沖液洗滌3 次并制成菌懸液，37℃、200 r/min 中間培養(yǎng)4 ～6 h，適當(dāng)稀釋后涂布LB 平板，37℃下培養(yǎng)過夜。挑取不同形態(tài)、大小和顏色的單菌落，用無菌牙簽分別點(diǎn)種在劃有小格子的LB 平板上，37℃培養(yǎng)12 ～14 h，4℃保藏以待噬菌體抗性的檢測。

表1 NTG 誘變體系的體積組成Table 1 Composition and concentration of NTG mutagesis system

1.4.2 抗噬菌體、高產(chǎn)L-Phe 的重組大腸桿菌突變株的篩選

初篩:采用單層平板法［4］。對(duì)平板上的單菌落逐一進(jìn)行噬菌體抗性的檢測，方法如下:挑取單菌落，與100 μL LB 培養(yǎng)基在TY 平板中混勻、涂布，在平板的4 個(gè)象限處分別滴加10 μL 噬菌體裂解液。靜置10 ～20 min，置于37℃培養(yǎng)12 ～24 h，觀察噬菌斑的出現(xiàn)。對(duì)4 個(gè)象限中均沒有噬菌斑的菌株進(jìn)行傳代培養(yǎng)，并對(duì)每1 代菌株以同樣的方法進(jìn)行噬菌體抗性檢驗(yàn)。對(duì)于傳代20 次以后仍沒有出現(xiàn)噬菌斑的菌株進(jìn)一步以TY 雙層平板法對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證，挑選出抗性菌株，作為初篩目的菌株，保藏，以備復(fù)篩。

復(fù)篩:將L-Phe 生產(chǎn)質(zhì)粒pAP-B03 轉(zhuǎn)化入初篩目的菌中，檢測重組菌搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)L-Phe 的能力，以WSH-Z06 (pAP-B03)為對(duì)照，挑選出在菌體生長和L-Phe 產(chǎn)量方面均沒有顯著降低的突變株，作為復(fù)篩目的菌株，用于L-Phe 的發(fā)酵生產(chǎn)。

1.5 感受態(tài)的制備及質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化方法

參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版［8］。

1.6 培養(yǎng)方法

大腸桿菌種子培養(yǎng)、搖瓶發(fā)酵和3 L 發(fā)酵罐發(fā)酵按照文獻(xiàn)［3］進(jìn)行。添加噬菌體的發(fā)酵則在培養(yǎng)初始時(shí)向培養(yǎng)基中添加1% (v/v)、1 ×1010PFU/mL 的噬菌體裂解液。

1.7 發(fā)酵參數(shù)檢測方法

菌體濃度(DCW)、葡萄糖濃度(Glc)和L-Phe產(chǎn)量測定方法按照文獻(xiàn)［3］進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 噬菌體BP-1 的分離、純化和形態(tài)特征

WSH-Z06 (pAP-B03)發(fā)酵生產(chǎn)L-Phe 的異常發(fā)酵液中感染的噬菌體，在TY 雙層平板上呈現(xiàn)形態(tài)、大小較一致的噬菌斑，后經(jīng)反復(fù)純化證實(shí)感染的是同一種噬菌體，將其命名為BP-1。其噬菌斑呈全透明狀，形態(tài)為圓形，直徑3 mm 左右［圖1(a)］。

經(jīng)透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，BP-1 呈蝌蚪狀，有一個(gè)多面體立體對(duì)稱的頭部，直徑約45 nm，有一長尾，尾長約125 nm，寬6 ～8 nm，無尾絲［圖1(b)］，初步判斷屬于長尾噬菌體科，λ 噬菌體屬。

2.2 pH 和溫度對(duì)BP-1 活性的影響

2.2.1 pH 對(duì)BP-1 活性的影響

BP-1 在不同pH 的蛋白胨水中處理后，其活性因pH 的不同而表現(xiàn)出明顯的變化。由圖2(a)看出，BP-1 的存活率與pH 之間的關(guān)系呈現(xiàn)鐘形分布;最適pH 范圍為5 ～8，在該范圍內(nèi)，BP-1 具有80%以上的存活率;在該范圍之外，隨著pH 的降低或增加，BP-1的存活率明顯下降，在pH 為2 和11 時(shí)，接近于0。

圖1 噬菌體BP-1 的噬菌斑(a)和電鏡下的形態(tài)(箭頭所指處)(×19 000)(b)Fig. 1 Plaques of bacteriophage BP-1 (a)and its transmission electron micrograph (b)

圖2 不同pH (a)和溫度對(duì)噬菌體BP-1 (b)活力的影響Fig. 2 Effect of pH (a)and temperature (b)on bacteriophage BP-1 viability

2.2.2 溫度對(duì)BP-1 活性的影響

通過測定不同溫度下BP-1 的活性，發(fā)現(xiàn)其在50℃和60℃下較穩(wěn)定，處理20 min 之后，活力仍保持在80%以上;而在70℃和80℃下活力隨著時(shí)間的延長而顯著下降，80℃處理20 min 之后，BP-1 的存活率幾乎降至0［圖2(b)］，說明噬菌體BP-1 對(duì)60℃以上的溫度比較敏感。

2.3 WSH-Z06 的NTG 誘變處理結(jié)果

經(jīng)過4 個(gè)不同濃度(0.2、0.4、0.6 和0.8 mg/mL)的NTG 處理后，挑選出416 株菌進(jìn)行BP-1 抗性的檢驗(yàn)，初步得到了6 株突變菌，分別命名為BR-42、BR-55、BR-95、BR-130、BR-183 和BR-184。

對(duì)6 株突變菌進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性檢驗(yàn)，淘汰了4 株不穩(wěn)定菌株;對(duì)剩下的BR-42 和BR-130 進(jìn)行鏡檢、EMB 平板驗(yàn)證等確證了這2 株菌是遺傳穩(wěn)定的抗BP-1 的大腸桿菌(見圖3)。

2.4 抗BP-1 的重組菌搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)L-Phe

對(duì)突變菌BR-42 和BR-130 進(jìn)行質(zhì)粒pAP-B03的轉(zhuǎn)化和搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，以WSH-Z06 (pAP-B03)為對(duì)照，結(jié)果見表2。

表2 不同的重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-Phe 的能力比較Table 2 Comparison of L-Phe production by different recombinant E. coli strains

圖3 NTG 誘變后的突變菌BR-42 和BR-130 對(duì)BP-1 的抗性檢測Fig.3 The examination of bacteriophage BP-1-resistance of E. coli mutants after NTG treatment

發(fā)酵結(jié)束時(shí)，對(duì)照菌的DCW 和L-Phe 產(chǎn)量分別為7.05 g/L 和4.47 g/L，而BR-130 (pAP-B03)的分別為3.67 g/L 和2.11 g/L，與對(duì)照菌相比，分別降低了48%和53%，這可能是由于NTG 對(duì)細(xì)胞的生理造成的損壞所導(dǎo)致的生長、代謝緩慢;而BR-42 (pAPB03)的DCW (7.18 g/L)和L-Phe 產(chǎn)量(4.24 g/L)均與對(duì)照無顯著差別，因此，選擇BR-42 (pAP-B03)進(jìn)行以后的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。

2.5 在添加噬菌體BP-1 條件下的搖瓶發(fā)酵

為了考察E.coliBR-42 (pAP-B03)在BP-1 存在條件下生產(chǎn)L-Phe 的能力，在500 mL 搖瓶水平上分別對(duì)BR-42 (pAP-B03)和WSH-Z06 (pAP-B03)進(jìn)行了2 組發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，其中一組是正常發(fā)酵培養(yǎng)，另一組是在發(fā)酵初始時(shí)向培養(yǎng)基中添加了1% (v/v)、效價(jià)為1 ×1010PFU/mL 的BP-1 裂解液，結(jié)果見表3。在BP-1 存在的條件下，WSH-Z06 (pAP-B03)的生長和生產(chǎn)L-Phe 的能力大大降低，分別是正常發(fā)酵時(shí)的40%和26%，發(fā)酵結(jié)束時(shí)的pH 值較正常發(fā)酵時(shí)高19%;而BR-42 (pAP-B03)的DCW、L-Phe 產(chǎn)量以及終pH 值在有BP-1 存在的情況下和正常發(fā)酵時(shí)均無明顯差別，表明BR-42 (pAP-B03)的生長和發(fā)酵能力不受噬菌體BP-1 的影響。

表3 添加噬菌體BP-1 條件下的兩組大腸桿菌搖瓶發(fā)酵參數(shù)比較Table 3 L-Phe production by E. coli WSH-Z06 (pAP-B03)and E. coli BR-42 (pAP-B03)in the presence of bacteriophage BP-1 in shake flasks

2.6 在添加噬菌體BP-1 條件下的3-L 發(fā)酵罐發(fā)酵

為了進(jìn)一步確證BR-42 (pAP-B03)對(duì)BP-1 的抗性，在3-L 發(fā)酵罐上分別對(duì)BR-42 (pAP-B03)和WSH-Z06 (pAP-B03)進(jìn)行了分批補(bǔ)料培養(yǎng)，并在發(fā)酵初始時(shí)添加1% (v/v)、效價(jià)為1 ×1010PFU/mL 的BP-1 裂解液，結(jié)果見圖4 和圖5。發(fā)酵2 h 后，WSHZ06 (pAP-B03)DCW 逐漸下降;8 h 時(shí)菌體形態(tài)變?yōu)闄E圓和圓形，長度只有正常時(shí)的1/4 左右，并伴有大量菌體裂解、致使形態(tài)模糊［圖4(b)］;14 h 時(shí)發(fā)酵液變澄清，顯微鏡下觀察只有極少量的橢圓形菌體，菌體幾乎完全被BP-1 裂解［圖4(c)］，被迫下罐;而BR-42 (pAP-B03)菌體生長和產(chǎn)L-Phe 能力幾乎沒有受到BP-1 的影響［圖4(d)、(e)、(f)和圖5(b)］，最大DCW 為15.41 g/L，發(fā)酵52 h 時(shí)L-Phe 產(chǎn)量達(dá)到34.87 g/L，該水平與初始菌株WSH-Z06 (pAPB03)正常發(fā)酵時(shí)(35.38 g/L)［3］無顯著差別。

2.7 WSH-Z06 (pAP-B03)對(duì)噬菌體的抗性機(jī)制

噬菌體對(duì)微生物細(xì)胞的侵染經(jīng)歷了吸附、DNA的注入、DNA 的復(fù)制和衣殼蛋白的裝配以及成熟噬菌體的釋放等4 個(gè)基本過程。抑制或阻止任一過程都可以使宿主菌具有抵御噬菌體的能力［9］。經(jīng)檢測，突變株WSH-Z06 對(duì)實(shí)驗(yàn)室保藏的其它λ 噬菌體同樣不敏感，而且該菌株不能利用麥芽糖為碳源進(jìn)行生長。據(jù)報(bào)道，麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白LamB 是λ 噬菌體尾絲蛋白與宿主菌的外膜蛋白特異性結(jié)合的受體［10－11］，由此可初步推斷WSH-Z06 對(duì)噬菌體的抗性機(jī)制可能與麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白LamB 的突變有關(guān)，即LamB 的失活阻止了噬菌體對(duì)宿主菌的吸附。分子水平和基因水平的噬菌體抗性機(jī)理還有待于進(jìn)一步的研究。

圖4 WSH-Z06 (pAP-B03)和BR-42 (pAP-B03)在添加BP-1 的條件下的菌體形態(tài)Fig.4 The cellular morphous of E. coli WSH-Z06 (pAP-B03)and BR-42 (pAP-B03)during the fermentation process in the presence of bacteriophage BP-1

3 結(jié)論

(1)利用雙層平板法從WSH-Z06 (pAP-B03)生產(chǎn)L-Phe 的異常發(fā)酵液中分離、純化到一株噬菌體BP-1，初步判斷其屬于長尾噬菌體科，λ 噬菌體屬。

(2)采用NTG 誘變處理WSH-Z06，檢測單菌落對(duì)BP-1 的敏感性和遺傳穩(wěn)定性，又經(jīng)鏡檢、EMB 平板驗(yàn)證初篩出2 株抗噬菌體BP-1 的突變菌BR-42 和BR-130。將生產(chǎn)L-Phe 的質(zhì)粒pAP-B03 轉(zhuǎn)化到突變菌中，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，獲得了菌體生長和L-Phe生產(chǎn)能力均無顯著降低的BR-42 (pAP-B03)。

(3)向培養(yǎng)基中添加1% (v/v)、效價(jià)為1 ×1010PFU/mL 的BP-1 裂解液，BR-42 (pAP-B03)最大DCW 達(dá)到15.41 g/L，在52 h 時(shí)，L-Phe 產(chǎn)量達(dá)到34.87 g/L，該水平與WSH-Z06 (pAP-B03)正常發(fā)酵時(shí)無顯著差別，說明BR-42 (pAP-B03)是1 株可以抗噬菌體BP-1 并能高產(chǎn)L-Phe 的優(yōu)良菌株，可以代替WSH-Z06 (pAP-B03)應(yīng)用于L-Phe 的工業(yè)生產(chǎn)中。

圖5 添加BP-1 條件下的E. coli WSH-Z06 (pAP-B03)(a)和E. coli BR-42 (pAP-B03)(b)的發(fā)酵過程曲線Fig. 5 L-Phe production by E. coli WSH-Z06 (pAP-B03)(a)and E. coli BR-42 (pAP-B03)(b)in the presence of bacteriophage BP-1

(4)初步推斷WSH-Z06 對(duì)噬菌體的抗性機(jī)制可能與麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白LamB 的突變有關(guān)，即LamB 的失活阻止了噬菌體對(duì)宿主菌的吸附，該機(jī)制還有待于進(jìn)一步的研究。

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