羅嬋，陳安均，崔慧玲，蒲彪，敖曉琳

(四川農(nóng)業(yè)大學 食品學院，四川 雅安，625014)

鮮切果蔬通常被消費者認為是較為安全的食品，但由于缺少更多的加工處理，因此也存在潛在的安全問題［1］。隨著鮮切果蔬消費量逐年增加，因食用新鮮果蔬及鮮切果蔬而引起的食源性疾病的爆發(fā)也愈加頻繁［2］。1996 年到2008 年期間，美國有82 起食源性疾病的爆發(fā)與食用鮮切產(chǎn)品有關，其中34%與消費綠葉類蔬菜有關，引起949 人患病，5 人死亡［3］。農(nóng)田灌溉、清洗用水、動物、用城市污水制作的肥料、帶菌的工人及不衛(wèi)生食品生產(chǎn)設備都是病原菌污染的來源，與鮮切果蔬相關的病原菌主要包括Escherichia coliO157:H7，Listeria monocytogenes和Salmonella［4］。

沙門菌屬(Salmonellaspp. )是與食源性疾病發(fā)作有關的最常見的病原菌，最初常見于家禽產(chǎn)品中，現(xiàn)也與鮮切產(chǎn)品相聯(lián)系。1998 －2002 年，美國爆發(fā)的食源性疾病事件中，有13.1%是由沙門菌屬引起的［5］，在我國，1994 －2003 年間，766 起細菌性食物中毒事件中沙門氏菌發(fā)生132 起，排名第2;中毒人數(shù)比例最大，為20.4%(8928 人)，在132 起事件中，以腸炎沙門氏菌所占比例最大，為26.5%［6］。英國的一項調查表明，腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌感染占到人類沙門氏菌感染病例的75%以上［7］。一系列被沙門菌感染的果蔬中，最常見的是生菜、發(fā)芽的種子、瓜類(如西瓜和甜瓜)和馬鈴薯。從原料供應到最終產(chǎn)品，沙門氏菌常從生菜、花椰菜、芽菜、芥菜苗、萵苣、菠菜、蘑菇、豆芽、苜蓿、未經(jīng)高溫殺菌的果汁和新鮮果蔬沙拉中分離出來［8］。

本試驗以蘋果、卷心菜、生菜為原料，研究了腸炎沙門氏菌在3 種鮮切果蔬中的生長情況，并考察4 種不同溫度(4、10、15、30℃)對腸炎沙門氏菌生長的影響，以期對GP 模型的預測準確性進行驗證，從而為控制鮮切果蔬中致病菌的生長提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料及菌株

生菜、卷心菜、蘋果均購于當?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場，運回實驗室后放置于4℃冰箱備用;腸炎沙門氏菌標準菌株CICC21482，四川農(nóng)業(yè)大學食品學院微生物實驗室饋贈。

1.1.2 培養(yǎng)基及主要儀器

亞硫酸鉍(BS)培養(yǎng)基，蛋白胨;HR40-ⅡA2 生物安全柜，青島海爾特種電器有限公司;SYQ-DSX-280B手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠;DNP-9126 型恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實驗設備有限公司。

1.2 樣品處理及接種

1.2.1 樣品的準備

生菜、卷心菜棄去外層受損葉片，流動自來水沖去葉片上的泥土，用鋒利的小刀切成3 cm ×0.5 cm(長×寬)左右的條，蘋果去皮后，切成1 cm3左右的小丁，置于50 mg/L 的ClO2溶液中殺菌2 min，無菌蒸餾水漂洗，撈出于無菌超凈工作臺中自然晾干。無菌操作，稱取10g 樣品于保鮮袋中，備用。

1.2.2 接種液準備

挑取腸炎沙門氏菌斜面培養(yǎng)物接種于10mL 無菌營養(yǎng)肉湯中，37℃培養(yǎng)14 h 后冷凍離心(5000 ×g，10 min)，棄上清液，加入10 mL 無菌營養(yǎng)肉湯，制成菌懸液，用無菌肉湯適當稀釋，獲得菌量約103～104CFU/mL 的接種液，接種液中SE 的數(shù)量通過涂布平板計數(shù)獲得。

1.2.3 樣品接種

采用點植法［9］，用移液器取0.1 mL 接種液，均勻接種在保鮮袋中的10 g 樣品中，大約15 個點左右，置于生物安全柜中自然晾干2h，使接種液中的SE 充分附著在樣品上。

1.2.4 處理

將接種好樣品的保鮮袋分別置于4、10、15、30℃條件下保藏7 d，定時取樣，4、10℃每12 h 取樣，15℃前2 d 每12 h 取樣，后5 d 每24 h 取樣，30℃第1 天每4 h 取樣，后6 d 每24 h 取1 次樣。

1.2.5 腸炎沙門氏菌的計數(shù)

取出保鮮袋后，無菌加入90 mL 無菌BPW 緩沖蛋白胨水，拍打2 min 后，無菌生理鹽水梯度稀釋，選擇合適的梯度稀釋液0.1 mL 涂布BS 培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基充分吸收菌液后，放至37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，然后計算SE 的數(shù)量。

1.2.6 應用的模型

應用ComBase 數(shù)據(jù)庫中的生長預測模型GP 預測SE 的生長，DMFit 軟件擬合SE 在3 種鮮切果蔬中各溫度下生長的觀察值，GP 是基于Baranyi 和Roberts 模型的預測模型，Baranyi 和Roberts 模型的表述為:

式中:N為t時微生物數(shù)量;N0為0 時微生物數(shù)量;Nmin為最小微生物數(shù)量;Kmax為最大相對死亡率;r，s為參數(shù)［10］。

1.2.7 模型可靠性評價

采用修正決定系數(shù)(Adjusted R Square，R2Adj)來評價模型的擬合度，R2Adj越接近1，表示預測模型對實驗數(shù)據(jù)擬合度越高。R2Adj用下式表示:

式中:R2為決定系數(shù);N代表預測模型中變量參數(shù)的個數(shù);n為試驗次數(shù)。

采用均方根誤差(Root Mean Square Error，RMSE)、準確因子(Accuracy factor，Af)和偏差因子(Bias factor，Bf)來評價已建立的SE 動力學預測模型的可靠性［11］。RMSE 越小，表示模型預測值的離散程度越小;Af越接近1，模型的準確度越高;Bf小于1表明，其預測的SE 在鮮切果蔬中的生長比實際生長速度慢。RMSE、準確因子和偏差因子用下式表示:

式中，Nobs是試驗實際測得的SE 數(shù)量;Npre是應用模型預測得到的與Nobs同一時間的SE 數(shù)量;n是試驗次數(shù)。

2 結果與分析

2.1 不同溫度下SE 在鮮切蘋果中的生長情況

鮮切蘋果中SE 的最初接種量在3.4 ～3.7log(CFU/g)之間。如圖1 中實際觀測值可見，4℃條件下，SE 的生長基本受到抑制，并有下降的趨勢;30℃下SE 在48h 內(nèi)生長迅速，最先生長到最大菌落數(shù)6.74log(CFU/g)，依次是15℃、10℃，但后兩者均未達到30℃條件下的最大菌落數(shù)。同時，30℃在48h后最先減少，穩(wěn)定期的時間也短于其他兩種溫度，當細菌數(shù)量減少到一定數(shù)量時，其在鮮切蘋果中的數(shù)量基本趨于穩(wěn)定，約在4.0 ～5.0log(CFU/g)之間。

用DMFit 軟件擬合SE 在不同溫度下的生長曲線，擬合的曲線由圖1 中的實線表示，結果見表1，10、15、30℃溫度下的擬合度較好，R2Adj分別是0.97、0.92、0.95，均高于4℃的0.72。從最大生長速率可以看出，4℃下156h 內(nèi)，SE 在鮮切蘋果中最大生長速率為負值，在剩余3 種溫度下，最大生長速率從大到小依次為30、15、10℃。用GP 預測SE 在肉湯培養(yǎng)基中的生長狀況，預測的生長曲線見圖1 中的虛線，SE在肉湯培養(yǎng)基的生長明顯不同于在鮮切蘋果中的生長，GP 對10、15℃的預測偏低，對30℃的預測則偏高。除4℃外，其在10、15、30℃3 種溫度下生長的最大菌落數(shù)均不能達到GP 所預測的最大值。

表1 DMFit 軟件對不同溫度下SE 在鮮切蘋果中的擬合結果Table 1 Results are fitted by DMFit software of SE in fresh-cut apple at different temperatures

2.2 不同溫度下SE 在鮮切卷心菜中的生長情況

鮮切卷心菜中SE 的最初接種量在3.1 ～3.7log(CFU/g)之間。如圖2 中實際觀測值可見，4℃下基本受到抑制;10、15、30℃下SE 分別在72、48、48h 生長到最大菌落數(shù)6.61、6.54、6.69log(CFU/g)。10℃在108h 后菌數(shù)開始減少，而15、30℃在達到最大菌落數(shù)后的數(shù)量基本趨于穩(wěn)定，約在5.8 ～6.0log(CFU/g)之間。

DMFit 軟件擬合的曲線由圖2 中的實線表示，其結果見表2，4、10、15、30℃下R2Adj分別是0.81、0.98、0.90、0.90，4℃下156h 內(nèi)，SE 最大生長速率為負值，而在其余3 種溫度下，最大生長速率從大到小依次為30、15、10℃。用GP 預測其生長曲線見圖2 中的虛線，GP 對10℃的預測偏低，對30℃的預測則偏高。

圖1 不同溫度下SE 在鮮切蘋果中的生長特征與GP 預測曲線Fig.1 Growth characteristics and predictive curves by GP of SE in fresh-cut apple at different temperatures

圖2 不同溫度下SE 在鮮切卷心菜中的生長特征與GP 預測曲線Fig.2 Growth characteristics and predictive curves by GP of SE in fresh-cut cabbage at different temperatures

表2 DMFit 軟件對不同溫度下SE 在鮮切卷心菜中的擬合結果Table 2 Results are fitted by DMFit software of SE in fresh-cut cabbage at different temperatures

2.3 不同溫度下SE 在鮮切生菜中的生長情況

鮮切生菜中SE 最初接種量在3.4 ～3.7log(CFU/g)之間。如圖3 中實際觀測值可見，4℃下基本受到抑制;10℃、15℃、30℃下SE 分別在48、48、24 h 進入穩(wěn)定期。10℃達到最大菌落數(shù)后的數(shù)量基本趨于穩(wěn)定，15、30℃在進入穩(wěn)定期后數(shù)量就開始減少。

DMFit 軟件擬合的曲線由圖3 中的實線表示，其結果見表3，4、10、15、30℃下R2Adj分別是0.92、0.99、0.95、0.94，4℃下156h 內(nèi)，SE 最大生長速率為負值，而在其余3 種溫度下，最大生長速率從大到小依次為30、15、10℃。用GP 預測其生長曲線見圖3 中的虛線，GP 對10℃的預測偏低，對30℃的預測則偏高。

圖3 不同溫度下SE 在鮮切生菜中的生長特征與GP 預測曲線Fig.3 Growth characteristics and predictive curves by GP of SE in fresh-cut lettuce at different temperatures

表3 DMFit 軟件對不同溫度下SE 在鮮切生菜中的擬合結果Tab.3 Results are fitted by DMFit software of SE in fresh-cut lettuce at different temperatures

2.4 預測值相對于實測值的Af及Bf

GP 模型的預測值與DMFit 軟件擬合的實測值的準確因子(Af)及偏差因子(Bf)見表4。

表4 GP 模型的預測值相對于實測值的Af及BfTab.4 Accuracy and bias factors of GP model compared with observations

3 結論與討論

腸炎沙門氏菌可以在10、15、30℃的鮮切蘋果、卷心菜、生菜中迅速生長，并且可以在4℃下存活，但是SE 在鮮切果蔬中的最大菌落數(shù)均不能達到GP 中的預測值，這與GP 模型的建立是基于肉湯液體培養(yǎng)基有關，當以食品為介質時，其預測存在一定的偏差［12］。本研究采用向原料食品中接種特定微生物來獲得數(shù)據(jù)建立模型，這種方法可以考察食品原料組織對特定微生物生長的影響，所建模型能更好預測特定微生物在實際食品中的生長［13］。蘋果、生菜切割后于30℃保存后的第2d 就開始腐敗，腐敗菌的大量生長及營養(yǎng)物質的消耗也會影響沙門氏菌的生長，同時，沙門氏菌對鮮切果蔬中本身存在的微生物如乳酸菌、腸桿菌也有顯著的敏感性［14］，使之不能達到理論的最大菌落數(shù)，也沒有達到4.0log(CFU/g)的增量，這結果與Vandamn［15］在22℃鮮切芹菜及Zhuang［16］在30℃土豆中的研究一致。但也有研究表明，沙門氏菌在25℃的鮮切桃中可生長到8.0log(CFU/g)［17］，其數(shù)量卻在25℃的苜蓿芽中有所下降，這與苜蓿芽的蠟狀角質層有關［18］。

鮮切果蔬的內(nèi)在因素(如果蔬本身的pH、營養(yǎng)物質組成等)及所處的外部環(huán)境均會影響致病菌的生長［19］，因此，SE 在不同的鮮切果蔬中的生長存在一定的差異，但是，影響其生長的最主要因素還是溫度及pH。本研究中，4℃可顯著抑制SE 在鮮切蘋果、卷心菜、生菜上的生長，這與Kakiomenou 等［20］的研究結果一致。在10、15、30℃下SE 的生長曲線相似，但生長速度不同，溫度越高，生長速度越快，最大菌落數(shù)越大。pH 已與溫度一同被認為是新鮮果蔬中影響微生物生長的決定性因素，但是，即便是酸性較高的產(chǎn)品(如蘋果)，致病菌也可在其上生長，甚至在10℃或以上溫度時以指數(shù)方式生長［21］。但也有研究表明沙門氏菌不能在pH 低于4.0 的環(huán)境中有規(guī)律地生長［22］，如24℃下pH3.6 ～3.8 的鮮切草莓，其原因可能是與果蔬中有機酸的種類有關［23］。

本試驗用DMFit 軟件對3 種鮮切果蔬中SE 在4種溫度下生長狀況進行擬合，DMFit 是基于Baranyi和Roberts 模型的擬合軟件，Baranyi 和Roberts 模型能夠在溫度波動條件下獲得較為理想的預測效果［24］，本試驗中，DMFit 只能擬合SE 在鮮切果蔬中生長的前段時間，擬合結果顯示4 種溫度下的擬合曲線均沒有延滯期。GP 模型對SE 的生長預測溫度范圍為7 ～40℃，因此，本研究中沒有對4℃下的Af及Bf進行討論，其余溫度下三種鮮切果蔬的預測值相對于實測值的Af在1.10 ～1.48 之間，Bf在0.82 ～1.48 之間，而Ross 曾提出，Af小于1.15，Bf介于0.9 ～1.05間可作為一個好的預測模型的判定標準，二者數(shù)值接近1，表示預測模型的可靠程度越高［12］。由此可見，本研究中GP 模型預測在一定程度上與實測值存在一定的差異。

本試驗研究了腸炎沙門氏菌在不同溫度下鮮切果蔬中的存活及生長，為確保鮮切果蔬的安全，可選擇4℃的冷藏溫度作為鮮切果蔬保存溫度，雖然GP模型對SE 的預測有一定的偏差，但在沒有更好的預測模型之前，GP 的預測仍具有參考價值，只是在安全風險評估中要考慮預測的誤差。同時，在果蔬采后及加工中運用良好農(nóng)業(yè)規(guī)范(GAP)、良好操作規(guī)范(GMP)及危害分析和關鍵控制點(HACCP)等方法也是十分必要的。

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