付潔 ，王瑜 ，程龍 ，徐小潔 ，張浩 ，宋海峰 ，葉棋濃

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 a.生物工程研究所；b.放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所；北京 100850

激活蛋白1（activator protein 1，AP-1）是一類由即刻早期應(yīng)答基因編碼的核轉(zhuǎn)錄因子，在哺乳動(dòng)物中，AP-1主要由 Fos家族（c-Fos、FosB、Fra-1和Fra-2）和Jun家族（c-Jun、JunB和JunD）組成。AP-1蛋白以同源（Jun-Jun）或異源二聚體（Fos-Jun）的形式發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用。基礎(chǔ)條件下，細(xì)胞中的AP-1以Jun同源二聚體為主，其表達(dá)水平和活性均很低；當(dāng)細(xì)胞受到生理和病理因素刺激時(shí)，如細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、應(yīng)激信號(hào)、感染、致癌劑等的刺激，細(xì)胞中的AP-1將以c-Fos和c-Jun異源二聚體為主，其表達(dá)水平和活性均迅速升高，激活下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在多種腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[1-2]。AP-1作為對(duì)外界信號(hào)發(fā)生反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子而且位于信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的末端，使外界信號(hào)和細(xì)胞功能之間建立起一定的聯(lián)系，因此已作為抗腫瘤藥物開發(fā)的重要靶標(biāo)之一。

調(diào)節(jié)AP-1活性的方式目前主要有以下幾個(gè)層面：二聚體的組成成分和量的不同，會(huì)在腫瘤發(fā)生發(fā)展的不同階段起到致癌或抑癌的效果[3-4]；轉(zhuǎn)錄水平或翻譯后水平的磷酸化修飾等調(diào)節(jié)方式[5-6]；蛋白質(zhì)間相互作用，如與癌蛋白（RAS）或輔助蛋白（糖皮質(zhì)激素受體GR或維甲酸受體RAR）等的相互作用也是調(diào)節(jié)AP-1轉(zhuǎn)錄活性的重要方式之一[7]。盡管已發(fā)現(xiàn)一些與AP-1相互作用的蛋白質(zhì)，但只能部分解釋腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制，且許多與AP-1相互作用的蛋白質(zhì)的臨床意義不清楚。由于AP-1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起極其重要的作用，因此與AP-1相互作用的新因子還在不斷被發(fā)現(xiàn)。哺乳動(dòng)物Fos家族中以c-Fos最重要，F(xiàn)os家族在調(diào)節(jié)AP-1活性和腫瘤發(fā)生發(fā)展過程等方面具有重要作用[8-10]。

我們擬構(gòu)建c-Fos蛋白的不同結(jié)構(gòu)域片段的真核表達(dá)載體，并在293T細(xì)胞中表達(dá)，利用免疫共沉淀技術(shù)確定構(gòu)建的結(jié)構(gòu)域的正確性，為進(jìn)一步研究與c-Fos相互作用的蛋白及其區(qū)域定位奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

人HEK293T細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室保存（用含10%熱滅活小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱）；大腸桿菌DH5α、FLAG-pcDNA3.0載體由本實(shí)驗(yàn)室保存；LipofectAMINE2000轉(zhuǎn)染試劑、DMEM培養(yǎng)基購自Invitrogen公司；小牛血清購自杭州四季青公司；限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶、PrimeSTAR HS DNA聚合酶購自TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、PCR回收試劑盒、顯色液均購自康維世紀(jì)公司；預(yù)染蛋白marker購自Fermentas公司；瓊脂糖珠偶聯(lián)的抗FLAG抗體購自Sigma公司；抗FLAG和抗HA標(biāo)簽抗體、蛋白酶抑制劑cocktail均購自Sigma公司；擴(kuò)增基因片段的PCR引物由上海生工生物有限公司合成。

1.2 c-Fos基因結(jié)構(gòu)域劃分及引物設(shè)計(jì)

以本實(shí)驗(yàn)室保存的FLAG-c-Fos（GenBank登錄號(hào)為NM_005252）質(zhì)粒為模板，根據(jù)文獻(xiàn)[11]將c-Fos全長(zhǎng)分為c-FosB、c-FosD和c-FosE等3個(gè)結(jié)構(gòu)域片段（圖1），用PCR技術(shù)設(shè)計(jì)引物（表1），將c-Fos分為3段結(jié)構(gòu)域克隆到FLAG-pcDNA3.0載體中，酶切位點(diǎn)采用BamHⅠ和EcoRⅠ。因?yàn)闃?gòu)建的表達(dá)載體在3'端含有FLAG標(biāo)簽編碼序列，因此將各結(jié)構(gòu)域擴(kuò)增片段后的終止密碼子在引物中去掉，使目的蛋白與標(biāo)簽融合表達(dá)。

圖1 c-Fos基因結(jié)構(gòu)域劃分模式圖

表1 引物及序列

1.3 PCR程序和體系

參照PrimeSTAR HS DNA聚合酶說明書進(jìn)行。在0.2 mL離心管中依次加入1 μL質(zhì)粒模板、引物各0.5 μL（儲(chǔ)存濃度 10 μmol/L）、5×PS緩沖液10 μL、dNTP 4 μL、0.5 μL PrimeSTAR 酶 ，用ddH2O將體系補(bǔ)足至50 μL。將上述混合液輕輕混勻，短暫離心。PCR反應(yīng)程序：95℃ 10 min，然后以95℃ 20 s、55℃ 20 s、72℃ 1 min 進(jìn)行 30 個(gè)循環(huán)，72℃ 7 min。取9 μL PCR產(chǎn)物，加入10×上樣緩沖液1 μL，混勻，上樣，進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，紫外凝膠成像儀驗(yàn)證條帶是否正確。

1.4 FLAG-c-Fos不同結(jié)構(gòu)域片段真核表達(dá)載體的構(gòu)建

瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，與FLAG-pcDNA3.0載體質(zhì)粒分別用BamHⅠ/EcoRⅠ雙酶切，將酶切后的目的基因與載體DNA分別用1.5%和1%瓊脂糖凝膠電泳回收，用T4DNA連接酶于16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂板后37℃溫箱中倒置培養(yǎng)至長(zhǎng)出克隆菌落。挑取克隆菌落放入5 mL含氨芐西林的LB培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min振蕩過夜培養(yǎng)，用質(zhì)粒小量純化試劑盒少量提取質(zhì)粒。表達(dá)載體質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定無誤后，將樣品送上海生工公司測(cè)序。

1.5 表達(dá)載體質(zhì)粒的提取

將測(cè)序結(jié)果序列比對(duì)后，樣品接入10 mL含有氨芐西林的LB培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min振蕩過夜培養(yǎng)，用Promega公司的質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，紫外分光光度法測(cè)定濃度和純度，D260nm/D280nm為1.8～1.9的質(zhì)粒保存在-20℃待用。

1.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和收集

293T細(xì)胞用含10%胎牛血清、2 mmol/L谷酰胺、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。將105細(xì)胞鋪24孔板，次日細(xì)胞融合率約為70%時(shí)用LipofectAMINE2000轉(zhuǎn)染試劑將1.5 μg FLAG-c-FosB、FLAG-c-FosD 和 FLAG-c-FosE質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后24～36 h以1000 r/min離心收集細(xì)胞，棄上清，用PBS洗滌一次，置冰上，加入1×SDS上樣緩沖液，充分裂解細(xì)胞后行SDS-PAGE，Western印跡檢測(cè)片段表達(dá)正確與否。

進(jìn)行免疫共沉淀的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞培養(yǎng)條件同上，將106細(xì)胞鋪35 mm直徑的小皿，次日細(xì)胞融合率約為70%時(shí)用LipofectAMINE2000轉(zhuǎn)染試劑將5 μgHA-c-Jun和 5 μgFLAG-c-FosB、FLAG-c-FosD、FLAG-c-FosE分別共轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后24～36 h，以1000 r/min離心收集細(xì)胞，棄上清，用PBS洗滌一次，置冰上。

1.7 共轉(zhuǎn)染蛋白分子的免疫沉淀

用0.5 mL預(yù)冷的細(xì)胞裂解液［1 mol/L Tris-HCl（pH8.0）2 mL、5 mol/L NaCl 2.5 mL、NP-40 0.25 mL、0.5 mol/L EDTA 1 mL、蛋白酶抑制劑0.1 mL、1 mol/L DTT 0.1 mL，用 ddH2O 補(bǔ)至 100 mL］冰浴30 min后超聲波裂解細(xì)胞，4℃、12 000 r/min離心，取適量上清與等體積2×SDS蛋白加樣緩沖液混勻作為input，-70℃保存?zhèn)溆糜诿庖哂≯E分析。將其余上清轉(zhuǎn)移到新的無菌管中，加入瓊脂糖珠偶聯(lián)的抗FLAG抗體，于4℃在旋轉(zhuǎn)混合器上孵育結(jié)合4 h后用裂解液洗滌瓊脂糖珠4次，每次4℃、3000 r/min離心3 min，洗滌完畢棄上清，向沉淀中加入30 μL 2×SDS蛋白加樣緩沖液，-70℃保存?zhèn)溆糜诿庖哂≯E分析。

1.8 免疫沉淀標(biāo)本的免疫印跡

將上述收集的免疫沉淀標(biāo)本煮沸10 min變性，經(jīng)10%SDS-PAGE分離，采用半干轉(zhuǎn)印儀，以15 V恒壓轉(zhuǎn)印50 min，將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以含30 g/L脫脂奶粉的TTBS［100 mmol/L Tris-HCl（pH7.5）、9 g/L NaCl，0.1%Tween-220］室溫封閉1 h，加1∶5000稀釋的HA-HRP或FLAGHRP抗體室溫孵育1 h，用TTBS洗滌后，用A/B液于X線膠片上曝光檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 c-Fos不同結(jié)構(gòu)域的構(gòu)建

c-Fos不同結(jié)構(gòu)域片段的構(gòu)建如圖1，PCR擴(kuò)增后獲得c-FosB、c-FosD和c-FosE片段，分別為441、237、531 bp（圖 2A），經(jīng)酶切、連接、轉(zhuǎn)化和挑取菌落，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定（圖2B），將酶切正確的質(zhì)粒送奧科生物公司測(cè)序，證實(shí)重組質(zhì)粒構(gòu)建正確（數(shù)據(jù)未示）。

2.2 c-Fos不同結(jié)構(gòu)域的表達(dá)

將c-Fos不同結(jié)構(gòu)域片段的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，收集細(xì)胞進(jìn)行Western印跡。c-FosB（147殘基）、c-FosD（79殘基）、c-FosE（176殘基）的理論相對(duì)分子質(zhì)量分別為 18×103、10×103、22×103，因連接有FLAG標(biāo)簽，表達(dá)產(chǎn)物比理論值略大（圖3）。

2.3 HA-c-Jun和FLAG-c-Fos不同結(jié)構(gòu)域片段的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)

免疫共沉淀方法檢測(cè)到FLAG瓊脂糖珠能將FLAG-c-FosB、FLAG-c-FosD和FLAG-c-FosE從細(xì)胞裂解液中沉降下來，并且在FLAG-c-FosD組可以特異性地檢測(cè)到HA-c-Jun的存在（圖4），說明本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的FLAG-c-FosD可特異性地與HA-c-Jun結(jié)合，而FLAG-c-FosB、FLAG-c-FosE不與HA-c-Jun結(jié)合，這與文獻(xiàn)報(bào)道的c-Fos和c-Jun形成異源二聚體依賴于bZIP區(qū)[16-17]相符。

3 討論

蛋白質(zhì)間相互作用存在于機(jī)體每個(gè)細(xì)胞的生命活動(dòng)過程中，包括復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、細(xì)胞周期調(diào)控和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等，特定蛋白質(zhì)相互作用發(fā)生改變可以導(dǎo)致疾病的發(fā)生，因此，基于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵蛋白進(jìn)行與其相互作用蛋白的篩選，是新藥研發(fā)的重要內(nèi)容之一。在AP-1信號(hào)途徑中，AP-1與其他蛋白質(zhì)的相互作用是AP-1發(fā)揮功能活性的重要方式之一。這些與AP-1相互作用的蛋白不但能改變AP-1活性，而且其本身基因結(jié)構(gòu)和/或表達(dá)水平在病理狀態(tài)下也可能發(fā)生改變，因此這些相互作用蛋白也是藥物開發(fā)的潛在靶標(biāo)。

圖2 c-Fos不同片段結(jié)構(gòu)域的構(gòu)建鑒定

圖3 利用FLAG標(biāo)簽抗體對(duì)c-Fos不同結(jié)構(gòu)域片段進(jìn)行表達(dá)鑒定

圖4 FLAG標(biāo)簽 c-Fos不同結(jié)構(gòu)域片段與HA-c-Jun的免疫共沉淀

AP-1通過蛋白質(zhì)間相互作用來發(fā)揮其功能至少有以下幾種方式：①通過AP-1不同成員之間的相互作用調(diào)節(jié)AP-1轉(zhuǎn)錄活性。細(xì)胞中AP-1的組成和各組分的相對(duì)比例決定了AP-1的功能[3-4]。②通過AP-1與其他蛋白質(zhì)的相互作用調(diào)節(jié)AP-1轉(zhuǎn)錄活性。如c-Jun或c-Fos可與一些Maf蛋白（v-Maf和c-Maf）相互作用形成異源二聚體；c-Fos還能與MafB、MafF、MafG和MafK相互作用，c-Jun則不能。通過這些相互作用，AP-1的功能大大增強(qiáng)[12-13]。一些調(diào)節(jié)蛋白也可通過與AP-1的相互作用抑制AP-1的功能。LaminA/C蛋白通過與c-Fos的相互作用改變c-Fos的亞細(xì)胞定位、抑制AP-1的DNA結(jié)合活性、抑制AP-1靶基因的轉(zhuǎn)錄激活，并導(dǎo)致細(xì)胞周期改變[14]。③AP-1通過與其他轉(zhuǎn)錄因子的相互作用調(diào)節(jié)AP-1或其他轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活性[15]。如屬于轉(zhuǎn)錄因子的雌激素受體（ER）可與AP-1相互作用并調(diào)節(jié)AP-1轉(zhuǎn)錄活性[6]，AP-1與轉(zhuǎn)錄因子Smad結(jié)合后可調(diào)節(jié)Smad介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）信號(hào)通路活性。因此，構(gòu)建AP-1家族主要蛋白的不同結(jié)構(gòu)域片段，對(duì)于研究其相互作用蛋白并進(jìn)一步功能定位，具有重要意義。

哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，AP-1家族的主要成員為Fos和Jun家族，其中，c-Fos是Fos家族的最重要成員。根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道[16-17]，c-Fos有多個(gè)結(jié)構(gòu)域可以激活或調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄，其中C端結(jié)構(gòu)域有3個(gè)Fos激活分子（Fos activation modlues，F(xiàn)AM），其中2個(gè)FAM區(qū)含HOB1和HOB2基序，第三個(gè)FAM區(qū)含TBP結(jié)合基序（TBP binding motif，TBM），TBM的TBP結(jié)合活性可以被含有HOB1和HOB2的激活結(jié)構(gòu)域放大；C-fos的N端含有一個(gè)抑制性結(jié)構(gòu)域（inhibitory do?main，ID1），可作用于含有HOB1基序的FAM區(qū)，使之沉默；C-Fos含有堿性亮氨酸拉鏈（bZIP）的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。我們希望獲得可以和c-Fos相互作用的蛋白，因此并未對(duì)c-Fos的N端和C端的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行細(xì)分，而只分為3個(gè)結(jié)構(gòu)域。本研究中免疫共沉淀結(jié)果也表明，bZIP與c-Jun結(jié)合，從而佐證了c-Fos不同結(jié)構(gòu)域構(gòu)建的正確性。

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