代曉朋 ，李軍鋒 ，張紅飛 ，張偉 ，趙光宇 ，于虹 ，郭彥 ，周育森

1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 微生物流行病研究所，病原微生物生物安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100071；

2.鄭州大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，河南 鄭州 450001

微小RNA（microRNA，miRNA）是一種內(nèi)源性的高度保守的由19～25個核苷酸組成的非編碼RNA，它能在轉(zhuǎn)錄后水平上通過調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)，參與細(xì)胞的凋亡與增殖、組織的分化、抗病毒免疫等生物學(xué)過程[1-2]。在對miRNA的功能研究中，怎樣使miRNA有效地高表達(dá)是一個重要方面。構(gòu)建表達(dá)miRNA的真核表達(dá)載體及將化學(xué)合成的miRNA模擬物（mimic）轉(zhuǎn)染細(xì)胞是目前常用的方法。但對部分細(xì)胞，如肝癌細(xì)胞系HepG2而言，存在轉(zhuǎn)染效率不高且重復(fù)性差等問題。而腺病毒表達(dá)系統(tǒng)具有宿主范圍廣、能在非復(fù)制型細(xì)胞中表達(dá)、復(fù)制效率高、沒有插入突變、表達(dá)水平高等特點(diǎn)[3-5]，因而得到廣泛應(yīng)用。

miRNA-192（miR-192）在肝細(xì)胞癌[6]、乳腺癌[7]、肺癌[8]、糖尿病患者腎臟[9]中表達(dá)異常，提示miR-192可能與這些腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系。深入研究miR-192對肝細(xì)胞功能的影響及分子機(jī)制是我們關(guān)注的問題。為了在肝細(xì)胞中高效表達(dá)miR-192，我們擬選擇構(gòu)建腺病毒表達(dá)系統(tǒng)，將miR-192前體基因插入重組腺病毒載體進(jìn)行包裝，感染肝細(xì)胞后檢測其表達(dá)情況。視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因1（retino?blastoma 1，RB1）為調(diào)控細(xì)胞周期的重要分子，其mRNA的3'UTR區(qū)域含miR-192結(jié)合序列[8]，我們將研究miR-192在肝細(xì)胞中是否調(diào)節(jié)RB1的表達(dá)。本工作將為探討miR-192在肝細(xì)胞中的功能及調(diào)節(jié)的靶基因提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

QBI-293A細(xì)胞、HepG2細(xì)胞、含pAdEasy-1腺病毒骨架的大腸桿菌BJ5183感受態(tài)、空腺病毒、pAdTrack腺病毒載體系統(tǒng)均為本研究室留存；大腸桿菌DH5α感受態(tài)、DNA marker、DNA凝膠回收試劑盒和小量質(zhì)粒提取試劑盒均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；pMD18-T載體系統(tǒng)、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNase抑制劑購自TaKaRa公司；胎牛血清、高糖型 DMEM 培養(yǎng)液（C12430）、LipofectAMINE2000試劑購自Invitrogen公司；限制性內(nèi)切酶購自NEB公司；定量PCR儀為Eppendorf公司產(chǎn)品；引物由上海生物工程有限公司合成。

1.2 穿梭載體pAdTrack-miR-192的構(gòu)建和鑒定

根據(jù)miR-192前體基因序列（GenBank：NR_029578.1）設(shè)計擴(kuò)增引物（表1）。提取HepG2細(xì)胞基因組，以其為模板擴(kuò)增miR-192前體基因。瓊脂糖電泳回收大小正確的條帶，與pMD-18T克隆載體相連，氨芐西林選擇培養(yǎng)，挑克隆菌培養(yǎng)后提質(zhì)粒酶切鑒定，對條帶大小正確的克隆進(jìn)行序列測定。將測序正確的重組質(zhì)粒用KpnⅠ和SalⅠ酶切，切下miR-192前體基因，連接到經(jīng)相同酶切的pAdTrack穿梭載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，卡那霉素抗性選擇陽性克隆，提質(zhì)粒并用XhoⅠ/BamHⅠ雙酶切鑒定，正確的重組質(zhì)粒（含有2個BamHⅠ酶切位點(diǎn)）理論上被切為750 bp、3.8 kb、5.1 kb等3條片段。將插入miR-192前體基因的穿梭載體命名為pAdTrack-miR-192。

1.3 miR-192重組腺病毒載體pAd-miR-192的構(gòu)建

將構(gòu)建的pAdTrack-miR-192用PmeⅠ酶切線性化，轉(zhuǎn)化含腺病毒骨架pAdEasy-1的大腸桿菌BJ5183感受態(tài)，卡那霉素抗性選擇培養(yǎng)24 h，挑選10個最小的克隆，根據(jù)文獻(xiàn)[10]用快速裂解法進(jìn)行初步篩選，選擇條帶最大的克隆，提質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)進(jìn)行擴(kuò)增，提質(zhì)粒后用PacⅠ酶切鑒定，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，如大條帶大于30 kb、小條帶大小為3或4.5 kb，說明該克隆為重組成功的腺病毒，命名為pAd-miR-192。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

在DMEM培養(yǎng)液（2 mmol/L谷氨酰胺，10%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素）中，于5%CO2、37℃恒溫孵箱中培養(yǎng)QBI-293A細(xì)胞。轉(zhuǎn)染用試劑為Invitrogen公司的LipofectAMINE2000，轉(zhuǎn)染方法依據(jù)操作說明書。

1.5 miR-192重組腺病毒的包裝和滴度測定

將重組成功的pAd-miR-192載體經(jīng)PacⅠ酶切線性化后，用膠回收試劑盒回收，經(jīng)DNA定量后轉(zhuǎn)染QBI-293A細(xì)胞，培養(yǎng)7 d后在顯微鏡下觀察細(xì)胞空斑病變，在熒光顯微鏡下觀察EGFP的表達(dá)，當(dāng)細(xì)胞中出現(xiàn)病變且視野中幾乎或局部全為綠色熒光時，表明重組腺病毒在QBI-293A細(xì)胞中包裝成功。收集包裝腺病毒的細(xì)胞，于-70℃/37℃反復(fù)凍融3次以裂解細(xì)胞，離心后取含有病毒的上清液于-70℃保存?zhèn)溆?。取空腺病毒和miR-192重組腺病毒再次感染QBI-293A細(xì)胞以擴(kuò)增病毒。經(jīng)過3次擴(kuò)增，根據(jù)文獻(xiàn)[11]的方法將病毒上清按1∶5的比例梯度稀釋，根據(jù)感染細(xì)胞中綠色熒光細(xì)胞的陽性數(shù)計算病毒滴度及感染復(fù)數(shù)（MOI）。

1.6 miR-192重組腺病毒在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)和檢測

在六孔板中接種HepG2細(xì)胞（2.5×105/孔），培養(yǎng)條件與QBI-293A一致，在恒溫孵箱中37℃培養(yǎng)18 h。吸去培養(yǎng)液，每孔補(bǔ)加新鮮的培養(yǎng)液500 μL。以空腺病毒為對照，每組重復(fù)3次。按照MOI為20的標(biāo)準(zhǔn)加入miR-192重組腺病毒，吸附1 h后補(bǔ)加1.5 mL培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，72 h后用熒光顯微鏡觀察綠色熒光的表達(dá)情況，以確定重組腺病毒是否感染HepG2細(xì)胞。收集成功感染的細(xì)胞檢測細(xì)胞中miR-192和RB1的表達(dá)。

1.7 q-PCR檢測病毒感染細(xì)胞中miR-192和RB1 mRNA的相對表達(dá)

依據(jù)莖環(huán)法定量檢測細(xì)胞中miRNA[12]，設(shè)計莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物和定量檢測上游引物（表1）。收集感染構(gòu)建的含miR-192前體基因的重組腺病毒和對照空腺病毒的HepG2細(xì)胞，提取RNA后，采用miR-192和U6莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物，用M-MLV酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后用miR-192和U6定量檢測上游引物分別和莖環(huán)結(jié)構(gòu)通用下游引物組合，根據(jù)各組細(xì)胞miR-192 和 U6檢測的 Ct值，利用 2-ΔΔCt法進(jìn)行相對定量分析，檢測miR-192在病毒感染細(xì)胞后是否表達(dá)miR-192。

用Primer Express 3.0軟件設(shè)計RB1的定量檢測引物（表1）。取過表達(dá)miR-192的細(xì)胞和對照細(xì)胞的RNA各1 μg，用M-MLV反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后用RB1和β-actin定量檢測引物，以β-actin為內(nèi)參，實(shí)時定量PCR檢測RB1 mRNA和β-actin的Ct值，利用 2-ΔΔCt法進(jìn)行相對定量分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

統(tǒng)計學(xué)分析所用軟件為GraphPad Prism 4，比較方式為成組t檢驗(yàn)，P＜0.05（雙側(cè)）表明差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 所需引物及序列

2 結(jié)果

2.1 miR-192前體基因的克隆

以HepG2細(xì)胞提取的基因組為模板擴(kuò)增miR-192前體基因，膠回收約670 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，連接T載體，構(gòu)建重組載體T-miR-192，對T-miR-192進(jìn)行EcoRⅠ/HindⅢ雙酶切鑒定（圖1）。酶切鑒定正確后，交北京奧科鼎盛生物科技公司進(jìn)行序列測定，表明獲得的miR-192基因序列與GenBank中完全一致。

2.2 表達(dá)miR-192的重組腺病毒載體的構(gòu)建

依據(jù)前述方法將miR-192前體基因與穿梭載體pAd-Track連接，用BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切（圖2），酶切片段大小與理論值一致，表明構(gòu)建了穿梭載體pAdTrack-miR-192。將鑒定正確的pAdTrackmiR-192用PmeⅠ酶切線性化后轉(zhuǎn)化含pAdEasy-1腺病毒骨架的大腸桿菌BJ5183感受態(tài)細(xì)胞，用卡那霉素抗性的培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)，挑選最小的克隆菌擴(kuò)增快速裂解鑒定，初步篩選，篩選到克隆后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)擴(kuò)增質(zhì)粒后用PacⅠ酶切鑒定，切出約4.5 kb的條帶，與理論值相符（圖2），表明構(gòu)建了表達(dá)miR-192的重組腺病毒載體pAd-miR-192。

2.3 含miR-192前體基因的重組腺病毒的包裝和擴(kuò)增

將經(jīng)PacⅠ酶切線性化的重組腺病毒載體pAd-miR-192轉(zhuǎn)染QBI-293A細(xì)胞，于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中孵育，熒光顯微鏡下檢測綠色熒光蛋白的表達(dá)。轉(zhuǎn)染第8 d時，在普通熒光顯微鏡下檢測到細(xì)胞病變，且綠色熒光充滿視野中的絕大多數(shù)細(xì)胞（圖3），提示病毒包裝成功。收集包裝細(xì)胞，-70℃/37℃反復(fù)凍融3次以收獲重組腺病毒pAd-miR-192，將病毒凍融上清液反復(fù)感染QBI-293A細(xì)胞以大量擴(kuò)增并收獲病毒。經(jīng)過3次擴(kuò)增，根據(jù)文獻(xiàn)[11]的方法將病毒上清按1∶5的比例梯度稀釋，根據(jù)感染細(xì)胞中綠色熒光細(xì)胞的陽性數(shù)計算病毒滴度為4×107PFU/mL，MOI為18。

圖1 miR-192前體基因的克隆和鑒定

圖2 表達(dá)miR-192重組腺病毒載體的鑒定

2.4 含miR-192前體基因的重組腺病毒細(xì)胞中的miR-192表達(dá)分析及靶基因分析

在六孔板中接種HepG2細(xì)胞，在恒溫孵箱中于37℃培養(yǎng)18 h，將擴(kuò)增的含miR-192前體基因的重組腺病毒與對照空腺病毒經(jīng)滴定后感染HepG2細(xì)胞，72 h后在熒光顯微鏡下觀察，可見視野中有大量綠色熒光（圖4A），說明重組腺病毒成功感染了HepG2細(xì)胞。收集2組細(xì)胞進(jìn)行miR-192及RB1定量檢測。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染含miR-192前體基因腺病毒的細(xì)胞中，miR-192的表達(dá)顯著高于轉(zhuǎn)染空腺病毒的細(xì)胞（P＜0.001）（圖4B），說明構(gòu)建的含miR-192前體基因的腺病毒感染HepG2細(xì)胞后，miR-192的表達(dá)水平遠(yuǎn)高于對照細(xì)胞，即成功構(gòu)建了可以高效表達(dá)miR-192的重組腺病毒，同時也建立了miR-192高表達(dá)細(xì)胞模型。為了檢測3'非翻譯區(qū)含miR-192結(jié)合位點(diǎn)的RB1在肝細(xì)胞是否是miR-192的靶基因，對2組細(xì)胞的RB1 mRNA進(jìn)行了相對定量分析。結(jié)果表明，感染重組腺病毒后細(xì)胞中RB1 mRNA的表達(dá)水平明顯下降（P＜0.001）（圖4C），表明在肝細(xì)胞中miR-192能夠靶向RB1 mRNA。

圖3 熒光顯微鏡下檢測pAd-miR-192轉(zhuǎn)染QBI-293細(xì)胞后GFP的表達(dá)（×200）

3 討論

miR-192最初由Lagos-Quintana等[13]克隆，隨后由Lim等[14]證實(shí)。目前確定miR-192前體基因位于人11號染色體上，與miR-194成簇共同轉(zhuǎn)錄；在肝組織和結(jié)腸組織中高表達(dá)，而在癌組織中低表達(dá)，在一些肝癌組織中其序列發(fā)生了突變。研究表明，在肺癌組織中miR-192低表達(dá)，抑制肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、H460、95D的增殖。在結(jié)腸癌細(xì)胞中，p53調(diào)節(jié)miR-192表達(dá)，miR-192的表達(dá)進(jìn)而抑制腫瘤治療的靶標(biāo)二氫葉酸還原酶的翻譯，可以促進(jìn)細(xì)胞G1和G2期的阻滯，參與了p53抑制腫瘤的過程[15]。

miR-192在肝細(xì)胞中表達(dá)豐度高，然而有關(guān)其對肝細(xì)胞功能的影響及調(diào)控的分子機(jī)制的報道卻很少，一些未知的功能和機(jī)制有待研究和闡明。在對miRNA進(jìn)行功能研究中，它的過表達(dá)和抑制是其中的一個重要而基本的環(huán)節(jié)?？紤]到腺病毒具有感染效率高、宿主廣泛、容易制備表達(dá)、不整合入染色體、表達(dá)效率高等優(yōu)點(diǎn)，我們選擇構(gòu)建miRNA的腺病毒載體。通過對所構(gòu)建的miR-192腺病毒的表達(dá)進(jìn)行分析檢測，發(fā)現(xiàn)miR-192在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)顯著提高，建立了miR-192過表達(dá)肝細(xì)胞模型，為進(jìn)一步研究其對肝細(xì)胞的功能影響打下了基礎(chǔ)。為了鑒定miR-192調(diào)控的分子，選擇在肺癌中的miR-192靶標(biāo)分子RB1進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)在肝癌細(xì)胞中過表達(dá)miR-192同樣可以明顯降低細(xì)胞中RB1 mRNA的水平。該實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了在肝癌細(xì)胞中RB1為miR-192的靶標(biāo)分子。綜上，我們建立的miR-192高表達(dá)肝細(xì)胞模型，在豐度和功能上實(shí)現(xiàn)了miR-192的過量表達(dá)，而且可用來驗(yàn)證靶基因。這為我們進(jìn)行miR-192的肝功能研究奠定了重要基礎(chǔ)，同時也為其他miRNA的研究提供了一種簡單高效表達(dá)所需miRNA的方法。

圖4 含miR-192前體基因的重組腺病毒感染肝細(xì)胞后miR-192的表達(dá)及靶基因分析

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