南雪，曾泉，王靜雪，張文成，房芳，王思涵，岳文，周軍年，裴雪濤

軍事醫(yī)學科學院 野戰(zhàn)輸血研究所，全軍干細胞與再生醫(yī)學重點實驗室，北京 100850

GATA-1發(fā)現(xiàn)于1991年，被稱為紅系特異核蛋白的轉錄因子，與此后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)的GATA-2～GATA-6一起構成GATA家族，該家族為鋅指結構家族的轉錄因子。GATA-1是研究最為充分的造血轉錄因子。在小鼠模型研究中，GATA-1敲除的小鼠在E10死于嚴重貧血[1-3]。此前的研究表明，GATA-1主要表達于成熟細胞，對紅細胞、巨核細胞、肥大細胞、嗜酸粒細胞的終末分化起重要作用[3-8]。也有報道指出，其對于巨核-紅系祖細胞（MEP）的維持和分化起重要作用[9-10]。甚至有報道稱GATA-1還表達于睪丸基質Sertoli細胞及非造血胚胎干細胞中[11]，這提示我們，GATA-1有可能在非造血細胞中亦發(fā)揮著不為人們所知的生物學功能。

此外，自1991年發(fā)現(xiàn)GATA-1蛋白以來，雖然在小鼠模型中進行的大量生物學研究[1-9]為全面揭示其功能奠定了基礎，但相對于小鼠GATA-1功能的研究，有關人GATA-1蛋白功能的研究報道還較少。在本研究中，我們將從人臍帶血cDNA中克隆人GATA-1全長CDS序列，對其進行過表達，并初步探討其在人非造血細胞（人臍靜脈內(nèi)皮細胞、人成纖維細胞）中的生物學功能。

1 材料與方法

1.1 材料

無菌條件下取產(chǎn)后新鮮臍帶，剪去夾痕和血塊，長度不少于15 cm，標本來自解放軍總醫(yī)院；無菌條件下取手術后20歲左右成人包皮組織，于含5%雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基中運送，48 h內(nèi)完成分離，標本來自解放軍307醫(yī)院。293T細胞由本室保存；pGEM-T Easy載體購自Promega公司；pBpLV質粒由意大利Vita Salute San Raffaele大學的Luigi Naldiai博士惠贈，保存于本室；小量質粒提取試劑盒及凝膠回收試劑盒購自愛思進生物技術公司；高糖DMEM培養(yǎng)基（HDMEM）、胎牛血清（FBS）購自GIBCO公司；EGM-2培養(yǎng)基購自Lonza公司；bFGF、EGF購自Peprotech公司；非必需氨基酸（NEAA）、L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉購自Hyclone公司；G418、膠原酶Ⅰ和Ⅳ、明膠、Polybrene購自Sigma公司；CD31-APC、KDR-PE及其同型對照購自Ebioscience公司；LipofectAMINE 2000、TRIzol、瓊脂糖購自 Invi?trogen公司；限制性內(nèi)切酶、dNTP、分子量標記及快速連接試劑盒購自TaKaRa公司；Taq DNA聚合酶購自NEB公司；抗人GATA-1抗體購自CST公司；HRP-IgG購自中杉金橋公司；引物合成、測序由上海英駿公司完成。

1.2 人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）的分離、培養(yǎng)與鑒定

用PBS緩沖液沖洗臍帶至無血細胞流出，用止血鉗夾緊臍帶一端，灌入濃度為1 mg/mL的膠原酶Ⅰ/Ⅳ混合液，充滿血管，夾閉另一端，于37℃、5%CO2孵箱中消化15～20 min；將臍靜脈內(nèi)的消化液以及用PBS沖洗1～2次的沖洗液一并注入離心管，室溫下1600 r/min離心10 min，收集下層細胞，加入EGM-2培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，次日更換培養(yǎng)基，隨后每2～3 d換液，待細胞生長至80%匯合，按1∶3的比例傳代；擴增至第6代后進行流式細胞術，檢測細胞表面抗原KDR-PE、CD31-APC的表達。

1.3 人包皮成纖維細胞（HFF）的分離與培養(yǎng)

用手術器械將清洗干凈的包皮組織剔除真皮下層的結締組織和血管組織后，剪為2～3 mm的組織塊，將其均勻貼附于10 cm平皿（提前用明膠包被處理）上，于37℃、5%CO2孵箱中倒置培養(yǎng)8～10 h，添加5 mL HDMEM完全培養(yǎng)基（含15%FBS），正置培養(yǎng)3～4 d，換液，1周左右即可見成纖維細胞在組織塊周圍爬出；待細胞生長至40%匯合，消化細胞，1∶1重鋪于新培養(yǎng)瓶中，正常培養(yǎng)，3～4 d傳代。

1.4 pBpLV-GATA1載體的構建

1.4.1 PCR擴增GATA-1 CDS序列 用Primer 5軟件，根據(jù)人GATA-1序列設計引物GATA-1 sense（GCTAGCACCatggagttccctggcctggggt）和 GATA-1 an?tisense（TCTAGAtcatgagctgagcggagccaccacagt）（ 其 中GCTAGCACC為NheⅠ酶切位點，TCTAGA為XbaⅠ酶切位點），引物合成及測序由上海英駿公司完成。從人全血單個核細胞中提取總RNA，反轉錄，然后以人cDNA為模板進行PCR擴增（反應條件：95℃5 min，以 95℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 30 s行 30 個循環(huán)，72℃ 7 min）。

1.4.2 pBpLV-GATA1載體的構建 將GATA-1 CDS序列的PCR產(chǎn)物與pGEM-T Easy載體連接，連接產(chǎn)物經(jīng)轉化及克隆擴大培養(yǎng)后提取質粒，用限制性內(nèi)切酶NheⅠ、XbaⅠ酶切鑒定并測序。將測序正確的重組質粒和pBpLV分別用NheⅠ和XbaⅠ雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳分離并分別回收1242 bp和8.4 kb的條帶后連接，此后進行連接產(chǎn)物的轉化、克隆擴大培養(yǎng)及質粒提取，重組質粒酶切鑒定，測序鑒定。獲得正確的pBpLV-GATA1重組質粒。

1.5 pBpLV-GATA1質粒的瞬時轉染

轉染前一天，以3×105～4×105/mL的細胞密度將293T細胞接種到6孔培養(yǎng)板上，細胞要達到90%～95%的融合。第2 d按每孔10 μL LipofectAMINE 2000、4 μg pBpLV-GATA1 質粒進行瞬時轉染，培養(yǎng)基采用Opti-MEM。在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育6 h后更換含血清的全培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72 h后檢測外源蛋白表達情況。

1.6 pBpLV-GATA1慢病毒包裝

293T包裝細胞培養(yǎng)于HDMEM完全培養(yǎng)基中，并添加0.1 mmol/L NEAA、2 mmol/L L-谷氨酰胺、500 mg/L G418，至90%匯合時用胰酶消化收集約6×106細胞，重懸于5 mL培養(yǎng)基中；分別將pBpLVGATA1（或空載體質粒）與包裝質粒pLP1、pLP2、pLP/VSVG，在無血清Opti-MEM培養(yǎng)基中與Lipo?fectAMINE 2000混合，室溫孵育20 min，然后加入293T細胞懸液中，充分混合，置10 cm細胞培養(yǎng)皿中，37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)過夜，次日用含1 mmol/L丙酮酸鈉的完全培養(yǎng)基換液，轉染48～72 h后收集上清，4℃、3000 r/min離心20 min去除細胞碎片，病毒液用0.45 μm濾膜過濾后加入細胞中或分裝凍存于-80℃冰箱。

1.7 HUVEC和HFF細胞轉染及流式細胞分選

分別取第6代HUVEC和第6代HFF，以適當密度接種于6孔板中，第2 d每孔加入2 mL毒液，同時加入6 mg/L的Polybrene促進病毒轉染，轉染過夜后更換新鮮培養(yǎng)基，次日于熒光顯微鏡下觀察轉染效率，擴大培養(yǎng)后進行流式分選（FACS），獲得高表達GATA-1的HUVEC-GATA-1和HFF-GATA-1細胞。

1.8 HUVEC-GATA-1和HFF-GATA-1細胞的擴大培養(yǎng)

將流式分選獲得的HUVEC-GATA-1細胞培養(yǎng)于EGM-2培養(yǎng)基中，并添加5 ng/mL bFGF、5 ng/mL VEGF、1%NEAA、1%丙酮酸鈉，每48 h換液，80%匯合時按1∶2傳代。將流式分選獲得的HFFGATA-1細胞培養(yǎng)于HDMEM完全培養(yǎng)基中，并添加1%NEAA、1% 丙酮酸鈉，每48 h換液，80%匯合時按1∶3傳代。

1.9 HUVEC-GATA-1和HFF-GATA-1細胞的生物學分析

1.9.1 細胞生長曲線測定 取擴大培養(yǎng)的對數(shù)生長期HFF-GATA-1細胞，按每孔100 μL培養(yǎng)基含1000個細胞的密度接種于7塊96孔板，每天在固定時間取一板細胞，將培養(yǎng)基更換為含CCK-8溶液的培養(yǎng)液（100 μL培養(yǎng)液中加入10 μL CCK-8液體），每孔加110 μL，繼續(xù)培養(yǎng)3 h后檢測D450nm值，連續(xù)檢測7 d。

1.9.2 細胞流式分析 取擴大培養(yǎng)的HFF-GATA-1和HFF-con細胞，分別按照說明書加入適量的PE-小鼠抗人CD90或PE-小鼠抗人CD29抗體，以PE-小鼠IgG作為同型對照，4℃孵育30 min后，PBS洗滌3次，重懸于500 μL PBS中，避光上機進行流式細胞檢測。

1.9.3 Western印跡 用胰酶分別消化收集各種瞬時轉染或慢病毒感染的穩(wěn)轉細胞株的細胞蛋白，用RIPA裂解過夜，各取100 μg，加入5×上樣緩沖液，煮沸5 min，經(jīng)10%SDS-PAGE后轉移至PVDF膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，再加入兔抗人GATA-1抗體（1∶500），4℃過夜，用TBST洗滌3次，每次10 min，加入HRP-山羊抗兔二抗（1∶2000），室溫孵育2 h，用TBST洗滌3次，每次10 min，ECL顯影；以β-actin為內(nèi)參。

在這一案例中，學生最初猜測“釘子板上圍占2格的圖形，可以圍多少個”的時候，多數(shù)學生認為可以圍2～3種，猜可以圍4種或4種以上的學生不足20%。學生最初圍出的圖形大致如圖1所示。

1.9.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 數(shù)據(jù)以x±s表示，采用t檢驗比較兩組間差異的顯著性，用Origin 6.0軟件包進行統(tǒng)計學分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 原代HUVEC與HFF的分離、培養(yǎng)、擴增與表型分析

分離獲得的HUVEC早期細胞為小多角形、球形，簇狀生長,經(jīng)傳代后呈單細胞生長，細胞體積增大，呈鋪路石樣并有旋禍狀排列，少數(shù)細胞伸展，生長速度穩(wěn)定，核清晰，圓形或橢圓形，核分裂相多見，胞漿豐富（圖1A），可穩(wěn)定傳代至少至18代。取第6代HUVEC進行流式細胞術檢測（圖2），其中CD31表達比例為100%，KDR和CD31雙陽性細胞表達比例為48%，CD34和CD31雙陽性細胞表達比例為42.4%，CD133和CD31雙陽性細胞表達比例為1.4%。CD34和CD133均為文獻所報道的人內(nèi)皮祖細胞標志[12-13]，提示我們分離的HUVEC細胞在商品化EGM-2培養(yǎng)條件下狀態(tài)良好，其中仍存有一定量的內(nèi)皮祖細胞樣細胞。

分離獲得的HFF細胞形態(tài)均一，呈典型長梭形，生長狀態(tài)良好，增殖能力旺盛，2～3 d即可進行傳代培養(yǎng)（圖1B）。

圖1 原代分離的細胞

2.2 pBpLV-GATA1載體的構建及鑒定

RT-PCR擴增人GATA-1 CDS序列，瓊脂糖凝膠電泳表明在約1242 bp的位置出現(xiàn)與預期結果一致的電泳譜帶（圖3A），然后將其克隆入T載體進行擴增和酶切鑒定并測序（序列略），測序正確后再將其CDS序列連入pBpLV載體，構建pBpLV-GATA1載體。用NheⅠ、XbaⅠ雙酶切后進行瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)約8.4 kb和1242 bp的條帶（圖3B），符合預期結果，同時將酶切鑒定正確的克隆進一步測序，挑取測序結果與NCBI報道的人GATA-1序列（NM_002049，CDS序列1242 bp）一致的克隆進行擴增和慢病毒包裝。獲得GATA-1慢病毒表達載體后，為確定GATA-1蛋白是否能成功過表達，我們首先在293T細胞里進行了質粒瞬時轉染實驗，對轉染3 d后的293T細胞進行了Western印跡檢測，結果表明構建的pBpLV-GATA1載體可成功過表達GATA-1蛋白（圖3C）。

2.3 穩(wěn)定過表達GATA-1細胞株的建立

在此基礎上，我們在293T細胞里進行了慢病毒的包裝，在病毒攻擊后的第3 d，在熒光顯微鏡下可以看到大量293T細胞發(fā)出綠色熒光（圖4A）。收集毒液，經(jīng)40%PEG濃縮后，重懸至所攻擊靶細胞的完全培養(yǎng)基中。HFF細胞或HUVEC細胞提前一天接種至6孔板中，HFF細胞接種密度為30%～40%，HUVEC細胞接種密度為80%～90%（HUVEC細胞增殖能力相對HFF細胞較弱，且HUVEC細胞對于慢病毒的感染不夠耐受，細胞死亡較多，故須增加接種細胞密度）。加入慢病毒毒液攻擊過夜后，換為正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細胞密度適當后采用胰酶進行傳代，待細胞達到合適數(shù)量后消化細胞成單細胞懸液，上機進行流式分選，獲得純化的GFP+目的細胞。圖4B所示為HFF-GATA1和HFF-con細胞流式分選結果，前者陽性率約為3%，后者為13.5%。與對照組HFF-con細胞相比，HFF-GATA1細胞感染效率較低，可能與插入了1242 bp的外源基因有關。圖4C所示為經(jīng)流式分選后，HFF-GATA1和HFF-con細胞的明場、熒光及merge的照片。對流式分選后的HFF-GATA1和HFF-con細胞進行Western印跡檢測，結果表明成功構建了過表達GATA-1的穩(wěn)轉HFF細胞株及其對照細胞株（圖4D）。

2.4 GATA-1對細胞增殖的影響

2.5 GATA-1對HFF細胞間質特性的影響

圖2 人臍靜脈內(nèi)皮細胞的雙色流式鑒定

圖3 pBpLV-GATA1重組慢病毒質粒的構建及鑒定

進一步我們要問，GATA-1是一個造血細胞特異性轉錄因子，其轉染至非造血細胞中影響了細胞增殖，這是否是通過影響靶細胞本身的細胞特性所致呢？為此我們對HFF-GATA1和HFF-con細胞進行了流式檢測（圖7）。CD90和CD29是典型的間質細胞（包括成纖維細胞和間充質干細胞）表面標志，檢測結果表明，與對照組細胞相比，GATA-1在HFF細胞中的過表達未影響CD90和CD29的表達。

3 討論

圖4 慢病毒包裝及HFF-GATA1穩(wěn)轉株的構建和鑒定

圖5 HUVEC-GATA1穩(wěn)轉細胞明場（bf）及熒光圖（GFP和merge）標尺：100 μm

自1991年發(fā)現(xiàn)至今，人們對小鼠GATA-1在造血中的功能進行了很多研究，但直接在人來源的細胞模型中對其進行研究相對較少。研究者往往采取間接研究的方式。如Yang等[14]在研究FOG-1（也稱為ZFPM1，是GATA-1的相互作用分子之一）在人CD34+造血干細胞中的功能及其對GATA-1的調(diào)控作用時，將小鼠的FOG-1過表達載體導入人CD34+造血干細胞中。雖然小鼠FOG-1與人FOG-1有一定的同源性，但在結構域上還存在差別，同樣小鼠GATA-1和人GATA-1的同源性也只有84%，因此不能簡單地將小鼠GATA-1在人細胞中過表達來進行研究。Miccio等[15]在研究GATA-1/FOG-1/NuRD信號通路在人β樣珠蛋白基因中的作用時仍采用了一種間接模式，即以攜帶人β樣珠蛋白基因的轉基因鼠作為研究模型，同時對FOG-1基因進行敲入操作，雖然構思巧妙，但在動物模型體內(nèi)仍然存在著這樣一種可能性，即不能完全反映人細胞中GATA-1等分子完全、真實的功能及其與其他分子的相互作用?？傊壳俺晒寺∪薌ATA-1全長的報道很少，在非商業(yè)化的載體共享網(wǎng)站Addgene上檢索不到人GATA-1的共享信息，只有小鼠GATA-1的共享信息，據(jù)我們的檢索，只有法國Chretien等在2009年發(fā)表的文章中使用了人GATA-1過表達載體[16]。為此，我們采用高保真PCR，從人臍帶血cDNA中克隆了GC含量高達61%的人GATA-1全長CDS序列，并實現(xiàn)了其在293T細胞和成纖維細胞中的過表達，從而為進一步研究其功能奠定了基礎。

圖6 HFF-GATA1穩(wěn)定轉染株的生長曲線測定

在此基礎上，我們對人GATA-1在人間質細胞中的功能進行了深入探討。我們的研究表明，在不表達GATA-1的人原代包皮成纖維細胞中，GATA-1對于HFF細胞的增殖有一定的抑制作用，即早期抑制增殖，后期被成纖維細胞克服。在我們實驗室此前的蛋白分子功能的研究中，我們也發(fā)現(xiàn)了這種早期抑制增殖現(xiàn)象。例如在大鼠肝干細胞樣細胞WB-F344中，我們發(fā)現(xiàn)Epimorphin蛋白在早期抑制增殖，但隨后被細胞克服[17]，有意思的是在人肝癌細胞系中這種抑制現(xiàn)象則觀察不到了[18]。同樣地，在研究GATA-1的功能時較多采用白血病細胞株[19]，可能導致觀察不到這種增殖抑制現(xiàn)象。我們還發(fā)現(xiàn)將人GATA-1導入HUVEC細胞，嚴重抑制了該細胞進一步的增殖和擴增，但限于難以大量獲得過表達GATA-1的HUVEC細胞，因此未做進一步的生長曲線分析。總之，我們的研究首次表明人GATA-1蛋白對于人間質細胞的增殖有一定的抑制作用，從而在Rylski等[20]的研究基礎上進一步拓寬了GATA-1的功能，他們在2003年發(fā)現(xiàn)GATA-1在紅系成熟過程中抑制細胞的增殖。

對過表達GATA-1的HFF細胞的進一步分析表明，間質細胞形態(tài)未發(fā)生改變，表達CD90、CD29的比例亦未發(fā)生改變?？紤]到造血、間質在胚胎發(fā)育和造血發(fā)育過程中具有密切關系[21-23]，我們實驗室此前的研究也首次表明在胚胎發(fā)育過程中，CD41+的永久造血細胞具有向成纖維細胞分化的潛能[24]，因此我們推測，GATA-1可能在造血早期發(fā)育過程中，抑制與造血細胞存在密切關系的非造血細胞（如內(nèi)皮細胞和間質細胞）的增殖和產(chǎn)生，但在造血發(fā)育后期，則抑制成熟血細胞的進一步增殖和擴增[20]。但GATA-1抑制間質細胞增殖的機制仍然需要我們進一步深入研究。

圖7 HFF-GATA1穩(wěn)定轉染細胞的流式檢測

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