楊偉偉,殷筱舒,殷黎靜,張艷麗,李高天,劉桂杰,俞利平,顧美兒,吳寶金

(1. 杭州師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心,浙江 杭州 310036;2. 山東省青島第十七中學(xué),山東 青島 266031;3. 江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心,江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

Plcd1轉(zhuǎn)基因小鼠的制備

楊偉偉1,殷筱舒2,殷黎靜3,張艷麗1,李高天1,劉桂杰1,俞利平1,顧美兒1,吳寶金1

(1. 杭州師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心,浙江 杭州 310036;2. 山東省青島第十七中學(xué),山東 青島 266031;3. 江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心,江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

通過制備Plcd1轉(zhuǎn)基因小鼠研究Plcd1基因功能.首先逆轉(zhuǎn)錄PCR獲得約2.2 kb的Plcd1基因全長,T載體克隆后測序驗(yàn)證;以pMD19-T-Plcd1為模板,通過設(shè)計(jì)引物及PCR擴(kuò)增引入酶切位點(diǎn),與pEF6/V5-His同時(shí)進(jìn)行酶切、連接,構(gòu)建pEF6/V5-His-Plcd1表達(dá)載體;經(jīng)真核表達(dá)驗(yàn)證后,酶切獲得目標(biāo)片段,顯微注射681枚受精卵,在82只仔鼠中獲得轉(zhuǎn)基因陽性首建鼠15只,其中13只穩(wěn)定遺傳并建系.PLCD1-HIS融合蛋白在睪丸組織中表達(dá),在皮膚組織中無表達(dá).Plcd1轉(zhuǎn)基因小鼠為Plcd1功能研究奠定了基礎(chǔ).

Plcd1;pEF6/V5-His-Plcd1;顯微注射;轉(zhuǎn)基因小鼠

磷脂酶C(phospholipase C, PLC)是磷酸肌醇途徑的關(guān)鍵酶之一.它水解磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(PIP2)產(chǎn)生第二信使：肌醇1,4,5三磷酸(IP3)和二脂酰甘油(DAG),分別介導(dǎo)蛋白激酶C(PKC)和胞內(nèi)Ca2+庫的釋放[1].在哺乳動物PLC超家族中,依據(jù)結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)活性機(jī)制,可分為六類十三種亞型,分別為PLC-β1-4、PLC-γ1-2、PLCδ1,3-4、PLC-ε、PLC-ζ和PLC-η1,2[2-3].Plcd1(phospholipase C delta 1 或PLC-δ1)因其蛋白結(jié)構(gòu)簡單,分布廣泛,具有重要的生物學(xué)功能,頗受研究者的重視.Plcd1已被證實(shí)與冠狀動脈痙攣、脂肪代謝及腫瘤形成與轉(zhuǎn)移等密切相關(guān).2003年Nakamura等[4]制備了Plcd1敲除小鼠,表現(xiàn)為被毛稀疏且易發(fā)腫瘤.2008年Runkel等[5]鑒定出一種稀毛伴雄性不育的olt/olt小鼠,經(jīng)遺傳互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證明,稀毛表型為Plcd1缺失所致.2009年吳寶金等[6]通過ENU誘變獲得一種隱性遺傳的稀毛小鼠snthr-1Bao,其突變基礎(chǔ)為Plcd1基因的缺失.現(xiàn)有資料顯示Plcd1基因缺失的小鼠均伴有顯著的被毛稀疏,而Plcd1高表達(dá)會出現(xiàn)何種表型尚未可知.本實(shí)驗(yàn)通過顯微注射方法建立Plcd1轉(zhuǎn)基因小鼠,期望為Plcd1基因功能的深入研究奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、細(xì)胞和動物

pMD19-T載體購于TaKaRa;DH5α大腸桿菌購于上海生工;pEF6/V5-His-LacZ表達(dá)載體由中科院神經(jīng)科學(xué)研究所孫強(qiáng)博士授贈; L929細(xì)胞由杭州師范大學(xué)劉小玲老師饋贈;清潔級 C57BL/6J(B6)及ICR小鼠來自杭州師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心,生產(chǎn)許可證：SCXK(浙)2011—0048,使用許可證：SCXK(浙)2011—0157.

1.1.2 主要試劑

TRIzol?Reagent購自invitrogen;RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit,High Fidelity PCR Enzyme Mix,BcuI (SpeI),Bsp119I (BstBI),Bsp68I(NruI)及VspI(AseI)購自Fermentas;兔源抗His-tag,Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)購于碧云天;兔源抗6-Histidine Epitope Tag Antibody購于Novus Biologicals;β-Actin(Rabbit mAb)和Anti-Rabbit IgG(H+L)Dylight 680 Conjugate購于Cell Signaling;其他試劑為國產(chǎn)分析純.載體構(gòu)建及內(nèi)切酶的選擇均使用Vector NTI Advance 11軟件進(jìn)行,引物設(shè)計(jì)使用DNAStar軟件.

1.2 方法

1.2.1 Plcd1基因的克隆及測序

取B6小鼠睪丸組織提取總RNA,具體操作參照TRIzol?Reagent說明進(jìn)行.常規(guī)反轉(zhuǎn)錄PCR法獲得Plcd1目的片段.PCR反應(yīng)體系(50 μL)：10×buffer(含Mg2+) 5 μL,dNTP(2.5 mM) 1 μL,Plcd1F引物(20 μM) 1 μL,Plcd1R引物(20 μM) 1 μL,Fidelity酶 1 μL,cDNA 2 μL,加蒸餾水至50 μL.反應(yīng)條件：94 ℃5 min,94 ℃30 s,55 ℃30 s,72 ℃2 m50 s,30個(gè)循環(huán),72 ℃10 min,4 ℃保存.參照pMD19-T Vector(TaKaRa)操作說明制備pMD19-T-Plcd1克隆載體.使用通用引物M13-47和RV-M進(jìn)行PCR驗(yàn)證及DNA測序,獲得無堿基突變的pMD19-T-Plcd1克隆載體.

1.2.2 pEF6/V5-His-Plcd1表達(dá)載體的構(gòu)建

以pMD19-T-Plcd1克隆載體為模板,進(jìn)行引物設(shè)計(jì),經(jīng)PCR方法分別在Plcd1目的片段上下游引入酶切位點(diǎn),酶切PCR純化產(chǎn)物制備帶有酶切位點(diǎn)的Plcd1目的片段;在pEF6/V5-His-LacZ表達(dá)載體上選擇相同的酶切位點(diǎn),酶切制備pEF6/V5-His載體;常規(guī)方法制備pEF6/V5-His-Plcd1表達(dá)載體.使用通用引物T7和BGH rev進(jìn)行PCR驗(yàn)證、雙酶切及DNA測序檢測,獲得pEF6/V5-His-Plcd1表達(dá)載體.

1.2.3 pEF6/V5-His-Plcd1體外表達(dá)檢測

將pEF6/V5-His-Plcd1表達(dá)載體電轉(zhuǎn)染導(dǎo)入L929細(xì)胞,選用指數(shù)衰減波形,在合適的細(xì)胞密度下,設(shè)電壓和電擊時(shí)間梯度,選擇較好的轉(zhuǎn)染條件.轉(zhuǎn)染后常規(guī)培養(yǎng)48 h待細(xì)胞爬片,使用兔源抗His-tag多克隆抗體與一抗稀釋液以1∶300倍比稀釋;Cy3標(biāo)記的山羊抗兔IgG(H+L)與PBS以1∶700稀釋,進(jìn)行常規(guī)的免疫反應(yīng).經(jīng)間接免疫熒光法在熒光顯微鏡下觀察融合蛋白的表達(dá).

1.2.4 顯微注射法制備Plcd1轉(zhuǎn)基因小鼠

選定合適的酶切位點(diǎn),雙酶切獲得含有調(diào)控序列和目的基因序列的DNA片段,制備顯微注射用DNA構(gòu)件.委托中科院神經(jīng)科學(xué)研究所進(jìn)行雄原核注射,移植于ICR(♀)受體小鼠,后代仔鼠全部進(jìn)行PCR初步檢測.

1.2.5 Plcd1轉(zhuǎn)基因小鼠的檢測

1.2.5.1 PCR初步檢測

常規(guī)方法提取待檢小鼠基因組DNA,以P-F和P-R為引物,進(jìn)行PCR初步檢測.PCR反應(yīng)體系(25 μL)：10×Buffer 2.5 μL;dNTP(2.5 mM) 0.5 μL ;P-F(20 μM) 0.5 μL ;P-R(20 μM) 0.5 μL;Taq酶(5 U/μL) 0.25 μL;DNA模板 1 μL;加滅菌水至25 μL.PCR反應(yīng)條件：94 ℃5 min,94 ℃30 s,59 ℃30 s,72 ℃50 s,30個(gè)循環(huán),72 ℃延伸10 min,4 ℃保存.2%瓊脂糖凝膠電泳,紫外燈下觀察,拍照.

1.2.5.2 Western Blot檢測

分別取Plcd1轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠的睪丸和皮膚進(jìn)行常規(guī)的蛋白提取,100 ℃變性5 min,用于SDS-PAGE電泳上樣.常規(guī)的蛋白印記方法進(jìn)行PLCD1-HIS融合蛋白的檢測.一抗為兔源抗6-Histidine Epitope Tag Antibody,以1∶1 000稀釋;內(nèi)參為β-Actin(Rabbit mAb),以1∶1 000稀釋;二抗為Anti-Rabbit IgG(H+L)Dylight 680 Conjugate,與PBST以1∶10 000稀釋.Odyssey蛋白掃描儀進(jìn)行掃描,記錄結(jié)果.

1.2.5.3 表型及遺傳穩(wěn)定性檢測

觀察比較Plcd1轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠被毛有無異常變化;取背部肩胛間毛發(fā)做鏡下觀察,檢測毛發(fā)結(jié)構(gòu)有無異常;同時(shí)將轉(zhuǎn)基因陽性小鼠分別與B6小鼠配種繁育F1代,PCR法檢測F1代仔鼠遺傳情況.

2 結(jié)果與分析

2.1 Plcd1基因全長及pMD19-T-Plcd1克隆載體的獲得

取B6小鼠睪丸組織提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA模板,使用引物Plcd1F:5’-CATGGACTCCGGTCGGGACTT-3’,Plcd1R:5’-CCCCCAGGCTTAGTCCTGGAT-3’,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,成功獲得約2.2 kb的Plcd1目的片段(圖1-A).PCR產(chǎn)物膠純化回收,與pMD19-T連接轉(zhuǎn)化DH5α,經(jīng)藍(lán)白斑篩選,以通用引物M13-47和RV-M進(jìn)行PCR驗(yàn)證(圖1-B),同時(shí)進(jìn)行DNA測序確認(rèn)(圖1-C).獲得無堿基突變的pMD19-T-Plcd1克隆載體,用于表達(dá)載體的構(gòu)建.

A:Plcdl基因電泳結(jié)果.泳道1,Plcdl;M:250 bp DNA Ladder Marker.B:PCR擴(kuò)增驗(yàn)證結(jié)果.泳道1,陽性的重組質(zhì)粒;M,同上.C:DNA測序結(jié)果.經(jīng)比對與標(biāo)準(zhǔn)序列一致.

2.2 pEF6/V5-His-Plcd1表達(dá)載體的獲得

在pMD19-T-Plcd1克隆載體的基礎(chǔ)上,Plcd1目的片段上下游末端分別設(shè)計(jì)帶有SpeI和BstBI酶切位點(diǎn)的Plcd1 引物(圖2-A),經(jīng)PCR擴(kuò)增、雙酶切獲得帶有酶切位點(diǎn)的Plcd1目的片段(圖2-B).同時(shí),雙酶切pEF6/V5-His-LacZ表達(dá)載體,制備約5.8 kb的pEF6/V5-His載體(圖2-C);常規(guī)法連接轉(zhuǎn)化DH5α,經(jīng)Amp抗性篩選,以陽性單克隆質(zhì)粒為模板,T7和BGHrev為引物,進(jìn)行PCR驗(yàn)證,成功擴(kuò)增Plcd1目的條帶(圖2-D);再經(jīng)SpeI和BstBI雙酶切,可見5.8 kb和2.3 kb的條帶,與pEF6/V5-His載體、Plcd1目的片段一致 (圖2-E);隨后選送4個(gè)單克隆樣本進(jìn)行DNA測序,選擇符合要求的1號樣本用于體外表達(dá)檢測.

A:引入酶切位點(diǎn)的Plcd1引物.在Plcd1上游ATG起始密碼子位置引入SpeI酶切位點(diǎn)，下游引入BstBI酶切位點(diǎn)的同時(shí)修改終止密碼子.B:Plcd1雙酶切結(jié)果.泳道1，帶有酶切位點(diǎn)的Plcd1目標(biāo)片段.C：pEF6/V5-His-LacZ載體雙酶切電泳結(jié)果.泳道1，5.8 Kb的pEF6/V5-His載體和3 Kb的LacZ,M:Lambda DNA/HindⅢ Marker.D:PCR驗(yàn)證電泳結(jié)果.泳道1,陽性重組質(zhì)粒.E:陽性重組質(zhì)粒雙酶切電泳結(jié)果.泳道1，5.8 Kb的pEF6/V5-His和2.3 Kb的Plcd1目的片段.F:細(xì)胞表達(dá)檢測結(jié)果.經(jīng)間接免疫熒光檢測，PLCD1-HIS融合蛋白在L929細(xì)胞的胞膜和胞質(zhì)內(nèi)有明顯表達(dá).

在細(xì)胞密度為2.5×107～3×107cells/mL,電壓和電擊時(shí)間為80 V/25 ms的條件下,將pEF6/V5-His-Plcd1表達(dá)載體導(dǎo)入L929細(xì)胞,經(jīng)間接免疫熒光法檢測,熒光顯微鏡下可見紅色熒光標(biāo)記的PLCD-HIS融合蛋白分布在胞膜和胞質(zhì)內(nèi) (圖2-F).

2.3 通過顯微注射獲得Plcd1轉(zhuǎn)基因小鼠

在確認(rèn)pEF6/V5-His-Plcd1真核表達(dá)的基礎(chǔ)上,選定NruI和AseI酶切位點(diǎn),經(jīng)雙酶切獲得4.5 Kb的Plcd1轉(zhuǎn)基因構(gòu)件片段(圖3-A,圖3-B).將3 ng/μL(約3 000拷貝/pL)濃度的DNA構(gòu)件,注射進(jìn)681個(gè)受精卵,選取優(yōu)質(zhì)存活胚胎393枚,移植給18只ICR代孕母鼠,其中13只小鼠懷孕,懷孕率為72.2%,最后獲得G0仔鼠82只.以G0代小鼠基因組DNA為模板,使用引物P-F：5’-CAGAGAGGAATCTTTGCAGC-3’和P-R：5’-GAAGCTCGGGATCAAGAATC-3’,進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測,獲得與預(yù)期目的片段長度(399 bp)一致的陽性小鼠15只(陽性率18.3%),部分凝膠電泳結(jié)果(圖3-C).

在PCR初步檢測的基礎(chǔ)上,我們將15只陽性首建鼠分別擴(kuò)群繁殖,其中1只首建鼠不育,1只繁育的后代全部為轉(zhuǎn)基因構(gòu)件陰性,未能遺傳,最終獲得13個(gè)系列穩(wěn)定遺傳的Plcd1轉(zhuǎn)基因小鼠.在此基礎(chǔ)上,隨機(jī)選擇其中6個(gè)系列Plcd1轉(zhuǎn)基因小鼠后代進(jìn)行PLCD1-HIS融合蛋白的Western Blot檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)睪丸組織中PLCD1-HIS融合蛋白高表達(dá),而皮膚中無表達(dá),6個(gè)系列Plcd1轉(zhuǎn)基因小鼠表達(dá)情況一致(圖3-D).Plcd1轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠比較,毛發(fā)密度無明顯差異(圖3-E),毛發(fā)結(jié)構(gòu)也未見異常,深入的表型分析尚未開展.

A：顯微注射用Plcd1轉(zhuǎn)基因構(gòu)件.包括hEF-1α啟動子、Plcd1目的基因片段、V5、His-tag和BGH. B：pEF6/V5-His-Plcd1雙酶切電泳結(jié)果.1泳道,4.5 kb顯微注射用Plcd1轉(zhuǎn)基因片段.C：PCR檢測轉(zhuǎn)基因小鼠.1-5泳道為轉(zhuǎn)基因陽性小鼠；6泳道為野生型小鼠. D：蛋白免疫印跡結(jié)果.PLCD1-HIS融合蛋白在P/t(Plcd1轉(zhuǎn)基因小鼠睪丸組織)中表達(dá),在P/s(Plcd1轉(zhuǎn)基因小鼠皮膚組織)中無表達(dá).野生型小鼠W/t和W/s中均無表達(dá).β-actin為內(nèi)參.E：Plcd1轉(zhuǎn)基因小鼠.外觀及毛發(fā)密度無明顯異常.

3 討 論

3.1 Plcd1基因的功能

Plcd1基因編碼756 kD的PLCD1蛋白,作為磷脂酶C家族一員,在胞內(nèi)磷酸肌醇代謝中發(fā)揮重要的作用,包括激素分泌、神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞、生長因子信號、膜運(yùn)輸、離子通道活力及細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)等一系列細(xì)胞活動.在細(xì)胞周期或者各種外源因素刺激下,PLCD1能夠穩(wěn)定地在核內(nèi)外穿梭,引起核內(nèi)環(huán)境或者結(jié)構(gòu)的變化,進(jìn)而控制細(xì)胞增殖、分化和凋亡[7].PLCD1核內(nèi)功能拓寬了酶的生物學(xué)功能,提示不依賴膜的磷酸肌醇循環(huán),在腫瘤表型形成中具有很關(guān)鍵的作用[8].何超等發(fā)現(xiàn),腫瘤抑制子基因座3p22.3上的PLCD1在胃癌發(fā)生機(jī)制中處于下游調(diào)節(jié)基因的地位[9],PLCD1由Rho相關(guān)的GTPases直接激活,通過GTPases控制的各種細(xì)胞支架調(diào)節(jié)細(xì)胞形態(tài)和運(yùn)動,提示在轉(zhuǎn)移癌侵襲行為上發(fā)揮作用[10].

有研究發(fā)現(xiàn),在冠狀動脈痙攣性心絞痛(coronary spastic angina,CSA)病人的皮膚成纖維細(xì)胞中,PLCD1的活性提高了3倍.CSA病人中也發(fā)現(xiàn)R257H變異使得PLCD1活性增強(qiáng)[11],p122蛋白作為PLCD1的正向調(diào)節(jié)子,在CSA病人中也有明顯上調(diào)[12].這種跡象顯示,PLCD1活性的增強(qiáng)很可能與冠狀動脈痙攣的發(fā)病機(jī)理相關(guān).Plcd1轉(zhuǎn)基因小鼠作為潛在的CSA動物模型,在揭示冠狀動脈痙攣的發(fā)病機(jī)制和上可能提供新的線索.

Masayuki等[13]發(fā)現(xiàn),與正常小鼠比較,高脂飼喂的Plcd1敲除小鼠表現(xiàn)為體重增加降低和代謝組織中脂滴聚積減少,葡萄糖耐量提高和胰島素敏感度增強(qiáng).此外,Plcd1在白脂肪組織和褐脂組織中高表達(dá),在骨骼肌中低表達(dá),在肝臟中極低表達(dá).Plcd1的組織特異性表達(dá)很可能導(dǎo)致脂肪組織中脂肪代謝異常.

如前言所述,多項(xiàng)工作顯示小鼠Plcd1功能缺失還會導(dǎo)致被毛缺失. Nakamura等[4]通過Plcd1敲除小鼠研究發(fā)現(xiàn)Pcld1基因與皮膚干細(xì)胞的分化方向有關(guān).Nakamura等[14]對裸鼠(Foxn1缺失)和Plcd1敲除小鼠的表型進(jìn)行比對研究,認(rèn)為Plcd1是裸基因Foxn1的下游基因.總體看來,Plcd1功能缺失導(dǎo)致被毛缺失的機(jī)制尚不明確.

3.2 Plcd1轉(zhuǎn)基因小鼠的特征及模型價(jià)值

本實(shí)驗(yàn)獲得了Plcd1轉(zhuǎn)基因小鼠,并對蛋白表達(dá)及大體特征進(jìn)行了初步觀察.Western Blot檢測結(jié)果顯示,在6只Plcd1轉(zhuǎn)基因首建小鼠后代中,PLCD1-HIS融合蛋白表達(dá)部位一致,提示其表達(dá)僅僅與構(gòu)建中的人延伸因子啟動子有關(guān)而未受轉(zhuǎn)基因構(gòu)件插入部位的影響.Plcd1基因缺失小鼠均伴有被毛稀疏表型,提示Plcd1與被毛稀疏具有密切的關(guān)系,但令人遺憾的是我們未檢測到Plcd1在小鼠皮膚表達(dá),也沒有發(fā)現(xiàn)被毛異常.由于其他組織類型中的Plcd1表達(dá)(如睪丸等)是確切存在的,PLCD1的高表達(dá)是否會造成其他方面的影響尚不清楚,后續(xù)工作需結(jié)合Plcd1功能特點(diǎn)及組織表達(dá)譜進(jìn)一步分析這些轉(zhuǎn)基因小鼠的表型特征,有利于確立Plcd1轉(zhuǎn)基因小鼠模型價(jià)值.

小鼠與人類的親緣關(guān)系較近,有著相似的生理與病理過程,因此小鼠模型對人類疾病病理機(jī)制的探索和發(fā)現(xiàn),有著其他模式生物不可替代的優(yōu)越性.目前Plcd1敲除或者突變?nèi)笔∈蠊灿?例報(bào)道[4-6],本實(shí)驗(yàn)室則第一次獲得高表達(dá)PLCD1的Plcd1轉(zhuǎn)基因小鼠.人類的很多疾病如高血壓、CSA、Alzheimer’s disease[15]、脊髓損傷、Pick’s disease、進(jìn)行性核上性麻痹、彌漫性Lewy體疾病、乳腺癌等,都有PLCD1異常表達(dá)的特征.雖然PLCD1異常表達(dá)與疾病之間具體關(guān)系和詳細(xì)機(jī)制仍然不清楚,相信通過Plcd1轉(zhuǎn)基因小鼠的詳細(xì)研究,有可能得到解決問題的線索或答案.

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EstablishmentofPlcd1TransgenicMice

YANG Weiwei1, YIN Xiaoshu2, YIN Lijing3, ZHANG Yanli1, LI Gaotian1,LIU Guijie1, YU Liping1, GU Meier1, WU Baojin1

(1. Laboratory of Experimental Animal Science, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036, China;2. Qingdao Number 17 Middle School of Shandong Province, Qingdao 266031, China;3. Laboratory Animal Center, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China)

In order to generatePlcd1 transgenic mice for the functional study ofPlcd1gene, the 2.2kb total length ofPlcd1 gene was RT-PCR amplified and cloned into T vector to construct pMD19-T-Plcd1vector at first. The targetPlcd1 fragment with proper restriction endonuclease sites was obtained by PCR amplification using specially designed primers and pMD19-T-Plcd1 template. This targetPlcd1 fragment and pEF6/V5-His vector were digested respectively bySpeIandBstBIin the same time, and then were connected together to construct pEF6/V5-His-Plcd1 vector. After it was verified to express in L929 cells, 4.5Kb length of transgenic construction including hEF-1α promoter,Plcd1,V5,His-tag and BGH was isolated and microinjected into 681 zygotes to produce 82 offspring. Finally, 13 hereditable lines were established from 15 positive transgenic founder mice. Western Blotting experiment revealed that PLCD1-HIS fusion protein was expressed in testicular tissue but not in the skin. ThePlcd1 transgenic mice provide potential material for the functional study ofPlcd1.

Plcd1; pEF6/V5-His-Plcd1; microinjection; transgenic mice

2012-10-15

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31071092);浙江省公益性技術(shù)應(yīng)用研究計(jì)劃項(xiàng)目(2012C37084);浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動計(jì)劃(新苗人才計(jì)劃)2011R421029.

吳寶金(1969—),男,教授,博士,主要從事人類疾病小鼠模型及分子遺傳學(xué)研究.E-mail:baojinwu@163.com

10.3969/j.issn.1674-232X.2013.01.001

Q95-33

A

1674-232X(2013)01-0001-07