杜方川，王 芬，神應強，陳燦玉，王安明

(1. 杭州師范大學生物醫(yī)藥與健康研究中心，浙江 杭州 311121；2. 杭州師范大學生命與環(huán)境科學學院， 浙江 杭州 310036；3. 杭州師范大學材料與化學化工學院， 浙江 杭州 310036)

非天然氨基酸修飾蛋白質研究進展

杜方川1,2，王 芬1,3，神應強1,2，陳燦玉1，王安明1

(1. 杭州師范大學生物醫(yī)藥與健康研究中心，浙江 杭州 311121；2. 杭州師范大學生命與環(huán)境科學學院， 浙江 杭州 310036；3. 杭州師范大學材料與化學化工學院， 浙江 杭州 310036)

蛋白質修飾是改善其物理化學和生物學特性的一種重要方法，目前已成為生物技術、生物催化和生物醫(yī)學領域的研究熱點.非天然氨基酸在蛋白質修飾中表現(xiàn)突出.介紹了非天然氨基酸種類及修飾方法，概述了其應用領域，以期為擴大利用此方法者提供參考.

生物正交反應；蛋白質修飾；非天然氨基酸；密碼子擴展

蛋白質僅僅用20種天然氨基酸執(zhí)行了一系列顯著功能，僅有的20種天然氨基酸攜有的功能基團數(shù)量有限，無法滿足化學、生物科學研究和應用中對蛋白質結構和功能的需求[1].目前，通過化學修飾、基因定點突變和計算機輔助蛋白質設計，雖然對蛋白質的結構改造賦予了天然蛋白質新的功能[2]，但這些方法都依賴于20種天然氨基酸本身[3]；其用于修飾改造的功能基團僅有巰基、羥基、羧基、氨基等幾種有限基團，功能化方式十分有限[4].與此相反，可人為賦予多樣性功能基團的非天然氨基酸(Unnatural Amino Acids，UAAs)在蛋白質修飾中表現(xiàn)突出[5]，這些UAAs含有酮基、醛基、疊氮、炔基、烯基、酰胺基、硝基、磷酸根、磺酸根等多樣性功能基團，可進行多種修飾反應，如：點擊化學、光化學、糖基化、熒光顯色等反應[6].通過UAAs對蛋白質進行修飾給其結構和功能的理論研究與應用帶來了新的契機.本文回顧了UAAs修飾蛋白質研究的最新進展，并對密碼子擴展法進行詳細介紹.

1 UAA種類

一系列UAAs已經(jīng)被用在細菌、酵母和哺乳動物細胞中進行蛋白質修飾，其精確性和效率非常高；它們大多都是20種天然氨基酸的衍生物，現(xiàn)今報道的UAA衍生物有苯丙氨酸衍生物、酪氨酸衍生物、谷氨酰胺衍生物、丙氨酸衍生物、半胱氨酸衍生物、絲氨酸衍生物、賴氨酸衍生物等[7].部分UAAs結構如圖1所示.

圖1 非天然氨基酸結構Fig. 1 The structure of unnatural amino acids

2 UAA修飾方法與過程

2.1 化學合成法

固相肽合成方法和半合成方法相結合能合成出含UAAs的大片段蛋白質[8].例如，在化學連接中，一個C端含α-硫脂的多肽將和一個N端含半胱氨酸的多肽反應，在經(jīng)歷一個?；嘏藕螅蛑I形成一個肽鍵將這兩個片段連接在一起[9].固相肽合成和連接技術已經(jīng)用于修飾蛋白質骨架、紅細胞生成素同系物、熒光探針、信號蛋白、離子通道、組蛋白等.然而這項技術的應用受所需要保護基團的化學性質、連接位點、蛋白質折疊等限制[1].

2.2 體外生物合成法

體外生物合成方法已經(jīng)合成了含UAA的蛋白質.在這個技術中，縮短了的tRNAs被酶法連接到化學氨酰化的核苷酸上，這些目的tRNA從連接的天然氨基酸上去耦掉，同時與非天然氨基酸結合；隨后細胞翻譯系統(tǒng)在相應的空白密碼子或者編碼密碼子下，使用這些帶有非天然氨基酸的氨?；膖RNAs合成蛋白質，但含有非天然氨基酸的氨?；痶RNA加合物穩(wěn)定性很差[10].

2.3 顯微注射法

在體內，通過顯微注射技術對蛋白質進行位點特異性修飾來自于體外生物合成方法的拓展.如非洲爪蟾蜍卵母細胞被顯微注射進2種RNA：一種是編碼蛋白質的mRNA，其目標位點含有UAG終止密碼子；一種是合成的氨?；^正tRNA(suppressor tRNA)，它能裝載相應的UAA.在體內，通過UAG終止密碼子對蛋白質進行位點特異性修飾，其中UAAs有酪氨酸同系物、α-羥基氨基酸等.但它繼承了體外生物合成方法的缺點，即校正tRNA必須在體外化學氨?；瘞蟄AA，氨?；膖RNA不能被重復利用，只能應用于能進行顯微注射的細胞[11].

2.4 營養(yǎng)缺陷型法

50年以前，研究者發(fā)現(xiàn)許多天然氨基酸的同系物能抑制細菌的生長，分析發(fā)現(xiàn)在這些氨基酸同系物存在下合成的蛋白質，其天然氨基酸已被同系物替換[10]，這是因為氨酰-tRNA合成酶(aminoacyl-tRNA synthetase, aaRS)不能明顯地把天然氨基酸和其同系物嚴格區(qū)分開來，例如，正亮氨酸(norleucine)能被甲硫氨酰-tRNA合成酶識別，氟苯丙氨酸(p-fluorophenylalanine)能被苯丙氨酰-tRNA合成酶識別[12].Merkel等[13]同時用4(S)-氟脯氨酸(4(S)-fluoroproline, (4(S)-F)Pro)，4-氟苯丙氨酸(4-fluorophenylalanine, (4-F)Phe)和6-氟色氨酸(6-fluorotryptophan, (6-F)Trp)3種UAAs對脂肪酶進行修飾，其脂肪酶的結構和活性均未被破壞.DNA聚合酶是一種高的動力學酶，Holzberger等[14]用大腸桿菌營養(yǎng)缺陷型菌株對DNA聚合酶中32個脯氨酸替換成4(R)-氟脯氨酸(4(R)-fluoroproline, (4(R)-F)Pro)，完成了(4(R)-F)Pro對DNA聚合酶的修飾，而DNA聚合酶在其保真度、活性和敏感方面均未發(fā)生變化.但運用營養(yǎng)缺陷性菌株來進行UAAs對蛋白質的修飾，沒有位點特異性、細胞不能持續(xù)生長，且UAAs僅是天然氨基酸的同系物[15].

2.5 翻譯后修飾法

蛋白質翻譯后修飾在生命體中具有十分重要的作用，它使蛋白質的結構更為復雜，功能更為完善，調節(jié)更為精細，作用更為專一.常見的蛋白質翻譯后修飾過程有泛素化、磷酸化、糖基化、脂基化、甲基化和乙酰化等.

Carrico等[16]通過在麥芽糖結合蛋白、人類生長激素和分枝桿菌磺基轉移酶蛋白中，引入一個含6個氨基酸的共有序列(LCTPSR)，它能被甲酰甘氨酸生成酶識別并修飾，從而生成醛基基團，新生成的醛基基團能進一步引入生物物理探針和抗原表位標簽到蛋白質中.Ohno等[17]用疊氮基酪氨酸(3-azidotyrosine)對鈣調蛋白進行修飾，再用三芳膦同系物對其進行選擇性的生物?；揎?，從而開創(chuàng)了一種新的蛋白質位點選擇性翻譯后修飾方法.

3 基于密碼子擴展修飾蛋白質

1.宿主細胞；2.校正基因載體；3.校正MjTyrRS基因載體；4.目標基因載體；5.特異非天然氨基酸；6.含非天然氨基酸蛋白質.

3.1 校正tRNA/aaRS對

在過去的20年中，正交tRNA/aaRS對(Orthogonal tRNA/aaRS pair)已在大腸桿菌、釀酒酵母和哺乳動物中相繼報道，其種類已超過20種(表1).

表1 正交tRNA/aaRS對

3.1.1 校正tRNA

圖3 校正tRNA篩選Fig. 3 Screening suppressor tRNA

圖4 校正aaRS篩選Fig. 4 Screening suppressor aaRS

3.1.2 校正aaRS

為篩選出識別特異非天然氨基酸的校正aaRS(suppressor aaRS)，對正交aaRS (orthogon-Al, aaRS)的活性中心殘基進行隨機突變產(chǎn)生一個aaRSs突變體文庫(>109個)，再通過陽性和陰性組合篩選出僅能識別某一非天然氨基酸的正交aaRS[43].陽性篩選——在非天然氨基酸存在下，正交aaRSs能氨?；翘烊话被峄蛱烊话被嵫b載到校正tRNA上，氨酰化tRNA通讀含特異堿基位點的氯霉素乙酰轉移酶(chloramphenicol acetyl transferase, CAT)基因，使宿主細胞存活在氯霉素(chloramphenicol, Cm)下，從而排除非正交aaRSs；陰性篩選——非校正aaRSs氨?；烊话被嵫b載到校正tRNA上，含特異堿基位點的核酸酶基因被翻譯，導致宿主細胞死亡，最終篩選出校正aaRS(圖4).

如O-甲基酪氨酸(O-Methyl-L-tyrosine)校正MjTyrRS篩選，通過MjTyrRS的X射線晶體結構分析，其識別酪氨酸的活性位點殘基為32位酪氨酸、107位谷氨酸、 158位天冬氨酸、 159位異亮氨酸和162位亮氨酸[44]；通過對MjTyrRS識別氨基酸的活性位點進行隨機突變產(chǎn)生aaRSs文庫，再通過上述陽性和陰性篩選，產(chǎn)生了識別O-甲基酪氨酸的校正MjTyrRS，其識別位點為32位谷氨酸、107位蘇氨酸、158位丙氨酸、159位異亮氨酸和 162位脯氨酸[22].

由于識別非天然氨基酸的aaRS篩選要產(chǎn)生一個>109的突變體酶庫，在通過3輪的陽性和陰性篩選，最后篩選出校正aaRS，其過程極其繁瑣和耗時.目前Armen等[45]通過基于分子對接的動力學和自由能計算，產(chǎn)生了一個能識別O-甲基酪氨酸的校正aaRS.

3.2 密碼子

3.2.1 三聯(lián)體密碼子

在蛋白質翻譯中，UAG終止密碼子指導蛋白質合成的終止，但大腸桿菌和釀酒酵母很少用其做終止密碼子[10].基于這一現(xiàn)象，將校正tRNA的反義密碼子突變?yōu)镃UA，再利用校正tRNA/aaRS對通讀UAG密碼子，完成UAA對蛋白質的修飾[19].

3.2.2 四聯(lián)體密碼子

為了減少生活污水懸浮雜質進入處理系統(tǒng)，避免水泵及管線堵塞，同時使中水系統(tǒng)運行處理流量平穩(wěn)，對沉淀池的出水口及厭氧池的轉水進行了改造[4-5]。

3.2.3 五聯(lián)體密碼子

3.3 摻入非天然氨基酸的數(shù)目

3.3.1 單個UAA

利用上述方法進行UAA對蛋白質的修飾是十分方便的，且已報道的UAA多達70多種，如對硝基苯丙氨酸[31]、O-甲基酪氨酸[47]、diazirine-賴氨酸[48]等.

3.3.2 兩個UAA

3.3.3 多個UAA

Young等[50]發(fā)現(xiàn)了一個對氰基苯丙氨酸校正aaRS(p-cyanophenylalanine suppressor aaRS)，它有高的底物通透性，在相同條件下可以結合18種UAAs，包括三氟醚酮(trifluoroketone-)、炔基(alkynyl-)和鹵素(halogen-)替代氨基酸.這給校正aaRSs的篩選提供了一條新的途徑，即篩選出識別某一系列的UAAs，而不是單個的UAA.

4 非天然氨基酸修飾蛋白質的應用現(xiàn)狀和前景

4.1 生物催化

4.1.1 提高酶催化活性

4.1.2 增強酶熱穩(wěn)定性

特氟龍能使阻燃和防火氟化高分子材料表面固化，受此啟發(fā)，紐約大學金·蒙克萊爾研究小組開創(chuàng)了一種能增強蛋白質界面的工藝過程.借助營養(yǎng)缺陷性菌株和在培養(yǎng)基中加入對氟苯丙氨酸，制備了對氟苯丙氨酸磷酸酯酶[52]，性能測試顯示，這種酶蛋白具有類似于特氟龍的耐熱性能，在60 ℃的高溫下仍可保持結構穩(wěn)定，同時活性和功能沒有絲毫減弱.在同樣溫度下，天然蛋白質分子中的氫鍵會斷裂，導致結構改變并發(fā)生蛋白質變性.通過此氟化氨基酸對蛋白質的修飾，給蛋白質熱穩(wěn)定研究開辟了新的視野.

4.2 蛋白質結構和功能探針

光誘導化學反應存在自然界中，它能調節(jié)許多細胞和生物功能，Wang等[53]用光反應非天然氨基酸對-(2-四唑)苯丙氨酸(p-(2-tetrazole)phenylalanine, (p-Tpa))對肌紅蛋白進行修飾，這給用光來調節(jié)蛋白質功能提供了可能.Lampe等[54]用[13C]對甲氧基苯丙氨酸([13C]p-methoxyphenylalanine)對P450進行修飾，修飾后P450和其它原子結合，可以用來闡明P450在配體位點的構象改變，同時也可以解釋哺乳動物P450的復雜動力學現(xiàn)象.

4.3 藥物蛋白

4.4 蛋白質交聯(lián)反應

蛋白質交聯(lián)在疫苗開發(fā)、藥物傳遞、功能型水合膠方面發(fā)揮著重要作用.這些交聯(lián)雖然發(fā)生在自然界中，但實驗室很難應用這個方法.Ayyadurai等[58]通過3,4-二羥-L-苯丙氨酸(3,4-dihydroxy-L-phenylalanine)對GFP蛋白進行修飾，從而實現(xiàn)了蛋白質與多聚糖的生物交聯(lián)，這給蛋白質交聯(lián)和合成生物學的發(fā)展帶來了新的希望.Bundy等[59]用對炔丙基氧苯丙氨酸(p-propargyloxyphenylalanine, (pPa))完成了二氫葉酸還原酶和超折疊綠色熒光蛋白的修飾，由于pPa含有酮基，它能在一價銅離子介導下使炔基與疊氮基發(fā)生交聯(lián)反應，同時pPa對UV不敏感，這使異源蛋白質間的交聯(lián)也成為了可能.

5 展 望

遺傳編碼UAAs能整合新的化學性質到蛋白質中，比其它蛋白質修飾方法更有優(yōu)勢，因為利用遺傳工程方法可以在肽鏈中選擇任意位置摻入非天然氨基酸，避免了普通化學修飾中修飾位點選擇的被動性；同時修飾中采用的非天然氨基酸與天然氨基酸結構類似，最大限度地保證了酶蛋白的結構穩(wěn)定和活性保留；20多種正交tRNA/ aaRS對，使70多種UAAs在無義密碼子和四聯(lián)體密碼子下完成了對蛋白質的修飾，其宿主涵蓋了大腸桿菌、酵母、哺乳動物細胞.為了進一步滿足蛋白質新化學性質需要，還需進行如下探索：1)開發(fā)新的tRNA/aaRS對用于識別新的UAA；2)創(chuàng)造新的獨特密碼子允許蛋白質含多個UAAs；3)進一步優(yōu)化轉移機制，使UAA修飾的蛋白更有效地表達.

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OntheModificationofProteinsbyUnnaturalAminoAcids

DU Fangchuan1,2, WANG Feng1,3, SHENG Yingqiang1,2, CHEN Canyu1, WANG Anming1

(1.Research Center of Biomedicine and Health, Hangzhou Normal University, Hangzhou 311121, China;(2.College of Biological and Environmental Sciences, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036, China;(3.College of Material, Chemistry and Chemical Engineering, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036, China)

Protein modification is an important method for improving the physicochemical and biological characteristics of protein, which has become a hotspot of bio-technology and bio-catalytic and biomedical field. The unnatural amino acids have an outstanding performance in the protein modification. This paper introduced the type of unnatural amino acid and modification methods, and summarized its application fields to provide references for espending the use of this method.

bioorthogonal reactions; protein modification; unnatural amino acid; codon extension

2013-01-10

國家自然科學基金項目(20906016)；浙江省自然科學基金項目 (LY13B060008).；博士后特別資助項目(2013T60606).

王安明(1975—)，男，副研究員，博士， 主要從事生物化工研究.E-mail: waming@hznu.edu.cn

10.3969/j.issn.1674-232X.2013.05.011

O629.7;Q51

A

1674-232X(2013)05-0437-09