梁媛媛,溫漢華,郭衛(wèi)強,焦艷華

(杭州師范大學(xué)生物醫(yī)藥與健康研究中心，浙江 杭州 311112)

用于親和分離的鏈霉親和素磁性高分子微球的制備

梁媛媛,溫漢華,郭衛(wèi)強,焦艷華

(杭州師范大學(xué)生物醫(yī)藥與健康研究中心，浙江 杭州 311112)

本文使用戊二醛作為偶聯(lián)劑在氨基磁性高分子微球P(St-GMA-NH2)/Fe3O4的表面引入鏈霉親合素(streptavidin，SA)，制備得到鏈霉親和素磁性高分子微球(P(St-GMA-SA)/Fe3O4).使用掃描電鏡(SEM)、紫外光譜(UV)表征了P(St-GMA-SA)/Fe3O4的形貌與結(jié)構(gòu)，探討了反應(yīng)時間，微球用量對微球表面SA引入量的影響，并考察了P(St-GMA-SA)/Fe3O4對生物素化羊抗人抗體(BIgG)的親和吸附能力.結(jié)果表明當(dāng)反應(yīng)時間為12 h，P(St-GMA-NH2)/Fe3O4用量為75 mg時，SA的引入量可達到2.7 μg/mg，P(St-GMA-SA)/Fe3O4在室溫下能快速和BIgG結(jié)合，最大結(jié)合量為7.4 μg/mg，P(St-GMA-SA)/Fe3O4與BIgG形成的復(fù)合物對熱、酸、堿都表現(xiàn)出很好的穩(wěn)定性.

鏈霉親和素；磁性高分子微球；親和分離

0 前 言

鏈霉親和素(streptavidin，SA)是由鏈霉菌分泌的一種蛋白質(zhì)，分子量65 kD.鏈霉親和素分子由4條相同的肽鏈組成，肽鏈中的色氨酸殘基能和生物素中的活性基團形成特異性結(jié)合.一個鏈霉親和素分子能結(jié)合4個生物素分子，二者的親和常數(shù)可達到2.5×1013(mol/L)-1[1]，且與其他分子非特異性結(jié)合率很低，因此，表面修飾鏈霉親和素的磁性高分子微球可用于捕獲生物素標(biāo)記的生物分子，包括生物素標(biāo)記的抗原抗體和核酸、蛋白質(zhì)等，在免疫檢測、DNA分離檢測、細胞分離、蛋白質(zhì)純化等領(lǐng)域顯示出廣闊的應(yīng)用前景[2].

本文將以自制的氨基化磁性高分子微球P(St-GMA-NH2)/Fe3O4為原料，戊二醛為偶聯(lián)劑，制備表面修飾鏈霉親合素的磁性高分子微球P(St-GMA-SA)/Fe3O4，對其結(jié)構(gòu)和性能進行表征，并考察其對生物素化羊抗人抗體(BIgG)的親和吸附能力.

1 實驗部分

1.1 試 劑

苯乙烯(St)(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，化學(xué)純，減壓蒸餾除去阻聚劑后使用)，甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)(上海靜超化工有限公司，化學(xué)純，減壓蒸餾除去阻聚劑后使用)，偶氮二異丁腈(AIBN)(上海試四赫維化工有限公司，化學(xué)純，用乙醇重結(jié)晶后使用)，聚乙烯吡咯烷酮(K-30)(天津天泰精細化學(xué)品有限公司)，己二胺(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，分析純)，鏈霉親和素(美國NEB公司)，生物素化羊抗人抗體(鼎國生物試劑公司)，油酸鈉，乙醇，氯化鐵，氯化亞鐵，氨水皆為市售品.

1.2 鏈霉親和素修飾的磁性高分子微球的制備

(1) P(St-GMA-NH2)/Fe3O4的制備.在5 g自制凍干的P(St-GMA)/Fe3O4磁性微球[3]中加入50 mL水和50 mL己二胺，超聲10 min混合均勻后轉(zhuǎn)移到250 mL三頸瓶中，機械攪拌，在80 ℃時反應(yīng)12 h.將反應(yīng)后的混合液進行磁分離后，用純水洗滌多次除去多余乙二胺，凍干得到棕黃色的粉末，即P(St-GMA-NH2)/Fe3O磁性微球.

(2) SA溶液的配置.用純水配制磷酸鹽(PB)緩沖液(0.1 mol/L，pH=7.0)，進行高壓滅菌，將1 mg的SA溶于1 mL的PB溶液中，取200 μL裝于EP管中待用.

(3) P(St-GMA-NH2)/Fe3O4分散液的配置.將50 mg P(St-GMA-NH2)/Fe3O4微球放入滅菌水中浸泡，用PB緩沖液清洗3次后，再加入2.5 mL PB，超聲分散10 min后待用.

(4) SA在P(St-GMA-NH2)/Fe3O4表面的偶聯(lián).取2.5 mL P(St-GMA-NH2)/Fe3O4分散液，加入2 mL的戊二醛室溫震蕩反應(yīng)6 h，進行磁分離，多次用大量純水清洗多余的戊二醛后，將磁性微球重新懸浮在2.5 mL PB緩沖液中，然后再加入到裝有200 μL的上述鏈霉親和素溶液的EP管中，室溫震蕩培養(yǎng)6 h.最后將P(St-GMA-SA)/Fe3O4分散在5 mL PB緩沖液中(濃度為10 mg/mL)，4 ℃保存待用.

1.3 P(St-GMA-SA) /Fe3O4形貌觀察

采用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察微球的形貌，應(yīng)用 SEM 照片分析微球的平均粒徑E(D).按式1計算微球的平均粒徑，其中，di表示微球的粒徑，ni表示粒徑為di時的微球個數(shù).

(1)

1.4 鏈霉親合素含量測定

(1) 配制不同濃度的鏈霉親和素標(biāo)準(zhǔn)溶液，用紫外分光光度計測定其在280 nm處的吸光度值，繪制濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示.

圖1 鏈霉親合素的濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 1 Standard curve of SA solution

(2) 將一定質(zhì)量的P(St-GMA-NH2)/Fe3O4微球分別放入EP管A中，加入滅菌水浸泡，用PB緩沖液清洗3次，加入2.5 mLPB超聲混均后加入2 mL的戊二醛室溫震蕩6 h，進行磁分離，然后多次用大量水清洗多余的戊二醛.再用PB緩沖液洗滌二次，磁分離除去上清液.將1 mg的SA溶于1 mL的PB溶液中，分別取200 μL裝入EP管B中，加入2.5 mL PB溶液，混合均勻，用紫外分光光度計測定其在在280 nm處的吸光度值，計為a.將上述SA溶液加入到EP管A中，室溫震蕩反應(yīng)6 h，磁分離取上清，測定其280 nm處吸光度值，計為b.則P(St-GMA-NH2)/Fe3O4中SA的含量用式2計算.

(2)

式中：ω: P(St-GMA-SA)/Fe3O4微球SA含量(μg/mg);

V: 溶液的體積(mL);

m: P(St-GMA-SA)/Fe3O4微球的質(zhì)量(mg).

1.5 P(St-GMA-SA)/Fe3O4對BIgG吸附量的測定

(1) 配制不同濃度的BIgG標(biāo)準(zhǔn)溶液，用紫外分光光度計測定其在275 nm處的吸光度，繪制其濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示.

圖2 BIgG的濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig. 2 Standard curve of BIgG solution

(2) 分別取1、2、3、4、5 mL自制的P(St-GMA-SA)/Fe3O4，裝入5個EP管中(編號為1-5)，磁分離除凈上清液.把200 μL一定濃度的BIgG裝在5個EP管中，加入2 mL PB溶液，混合均勻，用紫外分光光度計測定其在在275 nm處的吸光度，計為a；然后把它們分別加入到1-5號EP管中，室溫培養(yǎng)0.5 h，磁分離取上清液，測定其275 nm處吸光度，計為b.則P(St-GMA-SA)/Fe3O4對BIgG的吸附量用式3計算.

(3)

式中：ω: P(St-GMA-SA)/Fe3O4微球BIgG的吸附量 (μg/mg )；V：溶液的體積 (mL)；m：P(St-GMA-SA)/Fe3O4微球的質(zhì)量 (mg).

2 結(jié)果與討論

2.1 SA在P(St-GMA-NH2)/Fe3O4表面的引入

使用戊二醛作為偶聯(lián)劑，利用其醛基和P(St-GMA-NH2)/Fe3O4微球表面的氨基以及鏈霉親合素的氨基之間發(fā)生的親核加成反應(yīng)，在磁性微球表面引入鏈霉親合素，制備鏈酶親和素磁性高分子微球P(St-GMA-SA)/Fe3O4.反應(yīng)示意圖如圖3所示.

圖3 P(St-GMA-NH2)/Fe3O4 表面修飾鏈霉親合素示意圖Fig. 3 Illustration of preparation of P(St-GMA-SA) /Fe3O4

圖4是 P(St-GMA -NH2)/Fe3O4和P(St-GMA-SA) /Fe3O4的SEM照片，從圖中可以看出修飾前后的磁性微球粒徑和形貌未發(fā)生明顯變化，說明通過戊二醛偶聯(lián)反應(yīng)在磁性微球表面引入鏈霉親和素，對微球的形貌不會產(chǎn)生破壞，可滿足后續(xù)實驗要求.從SEM照片中選取100個微球進行統(tǒng)計分析，按式1計算可知P(St-GMA-SA) /Fe3O4平均粒徑為2.2μm.

圖4 P(St-GMA-NH2)/Fe3O4(a)和P(St-GMA-SA)/Fe3O4(b)的SEM照片F(xiàn)ig. 4 The SEM photographs of P(St-GMA-NH2)/Fe3O4(a) and P(St-GMA-SA)/Fe3O4(b)

圖5 反應(yīng)前(a)后(b)溶液的紫外吸收圖譜Fig. 5 Changes of UV-Vis(a,b) spectra before and after SA entrapment

由于SA在波長280 nm處存在紫外吸收，故可以通過檢測反應(yīng)前后溶液在該處波長的吸光度值變化確定SA是否在P(St-GMA-NH2)/Fe3O4表面引入以及引入量，反應(yīng)后殘液的吸光度值越低，說明SA在P(St-GMA-NH2)/Fe3O4表面的引入量越高.反應(yīng)前后的溶液紫外光譜如圖5所示.從圖中可以看出，反應(yīng)后溶液在280 nm處的紫外吸收峰強度下降，說明溶液中游離的SA濃度下降，即部分SA引入到了P(St-GMA-NH2)/Fe3O4表面，按式2可計算得到P(St-GMA-NH2)/Fe3O4表面的SA的引入量為2.7 μg/mg.

反應(yīng)結(jié)束后，去除上層殘液后，再加入等量PB，震蕩12 h后上清液的吸光度基本不變，說明SA通過戊二醛偶聯(lián)作用共價連接于P(St-GMA-NH2)/Fe3O4，而不是以物理吸附方式作用于微球表面[4].

2.3 反應(yīng)條件優(yōu)化

2.3.1 反應(yīng)時間

考察反應(yīng)時間對SA在P(St-GMA-SA)/Fe3O4表面引入量的影響，將P(St-GMA-NH2)/Fe3O4與戊二醛的反應(yīng)時間計為t1，進一步偶聯(lián)SA的反應(yīng)時間計為t2，實驗結(jié)果如表1所示.從表1中可看出，當(dāng)t2保持2 h不變，適當(dāng)延長t1，SA的引入量有所增加，但延至6 h后不再增加.保持t1為6 h，隨著t2的增加，SA的引入量增加，當(dāng)t2等于6 h時，再延長反應(yīng)時間，殘液的吸光度值基本保持不變，說明SA已和P(St-GMA-NH2)/Fe3O4反應(yīng)完全.故t1和t2均為6 h時，可獲得具有最大SA修飾量P(St-GMA-NH2)/Fe3O4微球.

2.3.2 磁性微球用量

圖6是不同用量的P(St-GMA-NH2)/Fe3O4微球?qū)A引入量的的影響.從中可看出，隨著微球用量增加，SA的引入量增加，當(dāng)微球用量為75 mg時，SA在微球表面的引入量已到達飽和，P(St-GMA-NH2)/Fe3O4表面SA的最大修飾量為2.7 μg/mg.

表1 SA引入量和反應(yīng)時間的關(guān)系

t1——P(St-GMA-NH2)/Fe3O4和戊二醛的反應(yīng)時間;

t2——進一步偶聯(lián)SA的時間;

a——反應(yīng)前SA溶液的吸光度值;

圖6 SA引入量和P(St-GMA-NH2)/Fe3O4用量的關(guān)系Fig. 6 Effect of quantity of the P(St-GMA-NH2)/Fe3O4 on the SA entrapment

b——反應(yīng)后上層殘液的吸光度值.

2.3.3 P(St-GMA-SA)/Fe3O4對BIgG吸附作用

圖7 P(St-GMA-SA)/Fe3O4對BIgG的吸附量與時間的關(guān)系Fig. 7 Effect of contact time on BIgG adsorption on the P(St-GMA-SA)/Fe3O4

鏈霉親和素分子由4條相同的肽鏈組成，肽鏈中的色氨酸殘基能和生物素中的活性基團形成特異性結(jié)合，為了考察P(St-GMA-SA)/Fe3O4對BIgG有特異親和作用能力，考察了P(St-GMA-SA)/Fe3O4對BIgG的結(jié)合量與時間的關(guān)系，結(jié)果如圖7所示.從圖7中可看出，在30 min內(nèi)，P(St-GMA-SA)/Fe3O4對BIgG結(jié)合量可達到7.4 μg/mg，再延長反應(yīng)時間，結(jié)合量無明顯變化.說明P(St-GMA-SA ) /Fe3O4微球能在較短時間內(nèi)捕獲溶液中游離的BIgG，其吸附容量與市售的Dynabeads? M-280磁珠相當(dāng).

為了考察P(St-GMA-SA)/Fe3O4與BIgG形成復(fù)合物的穩(wěn)定性，將其分別進行如下處理：

(1) 加入PBS，在50 ℃震蕩6 h.

(2) 加入HCl，調(diào)節(jié)pH值為1.0，震蕩6 h.

(3) 加入NaOH，調(diào)節(jié)pH值為13.0，震蕩6 h.

磁分離除去復(fù)合物，檢測上層清液的紫外吸光度值，均未發(fā)生明顯變化，說明P(St-GMA-SA)/Fe3O4與BIgG形成復(fù)合物未發(fā)生解離，對熱、酸、堿均表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，也進一步說明了BIgG是通過與微球表面的鏈霉親和素特異親和作用而固定于微球表面，而不是通過非特異的物理吸附作用與磁性微球結(jié)合.

3 結(jié) 論

(1) 用戊二醛作交聯(lián)劑，在P(St-GMA-NH2)/Fe3O4表面引入鏈霉親合素，微球平均粒徑為2.2 μm，粒徑分布均勻.

(2) 考察了反應(yīng)時間和P(St-GMA-NH2)/Fe3O4磁性微球用量對SA引入量的影響，當(dāng)P(St-GMA-NH2)/Fe3O4微球偶聯(lián)戊二醛，再偶聯(lián)鏈霉親合素的反應(yīng)時間均為6 h，磁性微球用量為75 mg時，SA引入量可達到2.7 μg/mg.

(3) 考察了P(St-GMA-SA)/Fe3O4對BIgG的親和結(jié)合能力，結(jié)果表明(St-GMA-SA)/Fe3O4能快速與BIgG結(jié)合，0.5 h內(nèi)即可反應(yīng)完全，BIgG最大結(jié)合量為7.4 μg/mg，所形成的P(St-GMA-SA)/Fe3O4-BIgG復(fù)合物對熱、酸、堿都表現(xiàn)出很好的穩(wěn)定性.

[1] Green N M. Avidin and strptavidin[J]. Methods Enzymol, 1990,184(3):51-67.

[2] 沈關(guān)心，周汝麟. 現(xiàn)代免疫學(xué)實驗技術(shù)[M]．武漢：湖北科學(xué)技術(shù)出版社，2002：223.

[3] 溫漢華，梁媛媛，黃志堅，等.分散聚合法制備含環(huán)氧基團的磁性高分子微球[J].杭州師范大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2011，10(2)：141-144.

[4] Savage D, Mattson G, Desai S,etal. Avidin-Biotin Chemistry: A Handbook[M]. Rockford: Pierce Chemical Co,1992:79.

PreparationofStreptavidinMagenticPolymerMicrospherefortheAffinitySeparation

LIANG Yuanyuan, WEN Hanhua, GUO Weiqiang, JIAO Yanhua

(Research Centre of Biomedicine and Health, Hangzhou Normal University, Hangzhou 311121, China)

Streptavidin magnetic polymer microsphere P(St-GMA-SA)/Fe3O4was prepared by introducing bimolecular streptavidin (SA) into the surface of P(St-GMA-NH2)/Fe3O4with the aid of glutaraldehyde as crosslinking agent. The paper characterized the appearance and structure of P(St-GMA-SA)/Fe3O4by SEM and UV, discussed the influences of reaction time and microsphere amount on the intake of SA, and investigated the affinity adsorption ability of P(St-GMA-SA)/Fe3O4to BIgG.The results show that the intake of can reach to 2.7 μg/mg in 12 hours when the (St-GMA-NH2)/Fe3O4dosage is 75 mg. P(St-GMA-SA)/Fe3O4is able to combine with BIgG to form stable complexes under mild conditions, which are stabile to heat, acid and alkali, and the maximum BIgG binding capacity is 7.4 μg/mg.

streptavidin; magnetic polymer microsphere; affinity separation

2012-11-20

浙江省公益計劃項目(2010C33132)；杭州科技計劃發(fā)展項目(20101133N04)；杭州師范大學(xué)科研啟動項目(PD10002004001040).

梁媛媛(1980—),女，助理研究員，博士，主要從事多功能納米復(fù)合材料研究.E-mail:liangyy@hznu.edu.cn

10.3969/j.issn.1674-232X.2013.02.012

TB34

A

1674-232X(2013)02-0145-05