張艷君,馮 川

(沈陽藥科大學(xué)醫(yī)療器械學(xué)校,遼寧 沈陽 117004)

·論 著·

八角蓮活性成分鑒別及其抗癌活性研究

張艷君,馮 川

(沈陽藥科大學(xué)醫(yī)療器械學(xué)校,遼寧 沈陽 117004)

目的對八角蓮化合物進行分離和鑒別，測定八角蓮成分的抗癌活性。方法采用滲漉、萃取、層析、色譜等方法提取、分離、鑒別化合物，采用MTT法測定鬼臼毒素的抗癌活性。結(jié)果從中分離得到3個化合物。并運用質(zhì)譜、核磁共振色譜等手段對化合物結(jié)構(gòu)進行解析，最終確定化合物為4′,5′-二去甲基鬼臼毒素、八角蓮醇和鬼臼毒素。MTT 法檢測結(jié)果顯示，不同濃度的鬼臼毒素處理SGC7901細胞24，48和72 h后，鬼臼毒素呈時間與劑量依賴性抑制SGC 7901胃癌細胞生長。結(jié)論八角蓮含有4′,5′-二去甲基鬼臼毒素、八角蓮醇和鬼臼毒素等化合物，其具有SGC7901細胞增殖抑制作用。

八角蓮;鬼臼毒素;SGC7901細胞增殖抑制

1 材料與方法

1.1儀器和試劑

Bruker AV 400 MHz超導(dǎo)核磁共振儀;Varian prostar制備型高效液相色譜儀，CO-150型二氧化碳培養(yǎng)箱(美國NBS公司),Sephadex LH-20柱層析凝膠(Pharmacia公司),DMSO(美國amresco公司),DMSO、MTT(美國Sigma公司),胎牛血清(Gibco公司)，RPMI 1640培養(yǎng)基(Hyclon公司)。

1.2試藥和細胞

鬼臼毒素，自制，配成相應(yīng)溶液備用。胃癌SGC 7901細胞株由中國醫(yī)科大學(xué)提供。

1.3提取和分離

八角蓮原藥材10 kg，粉碎成粗粉，用10倍量的80%乙醇滲漉提取3次，每次24 h，合并提取液，回收乙醇，減壓濃縮，得到總浸膏。浸膏用適量水溶解后分別用醋酸乙酯和正丁醇萃取，得到醋酸乙酯部分、正丁醇部分及水溶性部分。分別回收溶劑，取醋酸乙酯部分，采用了硅膠柱層析、反相中低壓層析、柱層析和HPLC等分離純化技術(shù)，從中分離得到3個化合物。

1.4鬼臼毒素抗癌活性

1.4.1細胞培養(yǎng)

胃癌SGC 7901細胞按常規(guī)培養(yǎng)在含有10%小牛血清的培養(yǎng)液(每100 mL含90 mL DMEM、10 mL小牛血清、0.1 g青霉素、0.1 g鏈霉素)中，于37 ℃，5% CO2，相對濕度為98%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞單層貼壁生長，待長至80%～90%細胞發(fā)生融合時，用含0.25%胰酶消化細胞傳代培養(yǎng)，收集對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.4.2MTT法檢測細胞生長

將對數(shù)生長期的人SGC 7901細胞懸液調(diào)整為5×104/L，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，實驗組分別加入3種不同濃度鬼臼毒素(5、10、20 mg/L)，對照組不加藥，每組設(shè)4個復(fù)孔，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于24、48、72 h后每孔加入MTT 20 μL。繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液,加入150 μL DMSO,振蕩10 min,用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔在490 nm處的吸光度(A490)值，按下式計算細胞抑制率。

抑制率(%)=(1-A實驗組/A對照組)×100%

1.5統(tǒng)計方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，各組間指標(biāo)的比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗，P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1黃色粉末，mp 219-221℃。1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：4.46(1H，d，J=3.2HZ)，2.89(2H，dd，J=3.2，1.6 HZ)，2.69(3H，m)，4.59(4H，d，J=10.8 HZ)，7.12(5H，s)，6.45(8H，s)，4.53-62(11H，m)，6.56(1′H，J=2.2 HZ)，6.12(6′H，d，J=2.2 HZ)，3.66(OCH3)，5.93(OCH2O);13C-NMR(75 MHz，DMSO-d6)δ：45.3(C1)，46.5(C2)，41.5(C3)，73.5(C4)，107.5(C5)，147.6(C6)，147.3(C7)，111.1(C8)，133.4(C9)，135.7(C10)，72.5(C11)，176.3(C12)，133.1(C1′)，107.5(C2′)，147.3(C3′)，134.3(C4′)，147.6(C5′)，112.3(C6′)，56.9(OCH3)，102.8(OCH2O)。

以上數(shù)據(jù)與文獻報道的4′,5′-二去甲基鬼臼毒素[5]一致,故確認(rèn)為4′,5′-二去甲基鬼臼毒素(圖1)。

化合物2白色無定形粉末。1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：6.92(2-H，s)，6.76(4-H，s)，6.78(6-H，s)，4.56(7-H，d，J=8.1 HZ)，2.66(8-H，m)，4.46(9α-H，dd，J=8.1，8.3 HZ)，4.76(9β-H，dd，J=4.5，8.5 HZ)，6.98(2′-H，d，J=3.1HZ)，6.76(5′-H，d，J=1.6 HZ)，6.86(6′-H，dd，J=1.5，8.1 HZ)，4.56(7′-H，d，J=7.8 HZ)，2.24(8′-H，m)，3.76(9′α-H，dd，J=5.1，11.2 HZ)，3.69(9′β-H，m)，3.86(3-OCH3，s)，3.86(3′-OCH3，s);13C-NMR(75 MHz，DMSO-d6)δ：134.5(C1)，109.8(C2)，145.5(C3)，114.3(C4)，147.5(C5)，119.6(C6)，75.6(C7)，51.1(C8)，69.4(C9)，132.7(C1′)，109.5(C2′)，147.3(C3′)，145.1(C4′)，114.5(C5′)，118.3(C6′)，83.3(C7′)，51.6(C8′)，61.3(C9′)，54.9(5-OCH3)，54.8(3′-OCH3)。

以上數(shù)據(jù)與文獻報道的八角蓮醇[6]一致,故確認(rèn)為八角蓮醇(圖2)。

化合物3白色晶體，mp 158-161℃，1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：4.76(1H，d，J=3.1 HZ)，2.97(2H，dd，J=3.2，1.5 HZ)，2.71(3H，m)，4.65(4H，d，J=8.8 HZ)，7.12(5H，s)，6.44(8H，s)，4.51-4.63(11H，m)，6.46(1′H，s)，6.42(6′H，s)，3.71(3′-OCH3，s)，3.72(4′-OCH3，s)，3.73(5′-OCH3，s)，5.93(OCH2O);13C-NMR(75 MHz，DMSO-d6)δ：45.4(C1)，46.3(C2)，41.9(C3)，73.2(C4)，107.2(C5)，148.9(C6)，148.6(C7)，110.3(C8)，135.6(C9)，132.4(C10)，72.6(C11)，177.3(C12)，138.1(C1′)，109.5(C2′)，153.3(C3′)，138.3(C4′)，153.6(C5′)，109.3(C6′)，56.9(3′-OCH3)，61.5(4′-OCH3)，56.9(5′-OCH3)，102.8(OCH2O)。

以上數(shù)據(jù)與文獻報道的鬼臼毒素[7-8]一致,故確認(rèn)為鬼臼毒素(圖3)。

圖 1 4′,5′-二去甲基鬼臼毒素 圖 2 八角蓮醇 圖 3 鬼臼毒素

2.2MTT比色法檢測結(jié)果

不同濃度的鬼臼毒素處理SGC7901細胞24、48和72 h后,鬼臼毒素呈時間與劑量依賴性抑制SGC 7901胃癌細胞生長。低濃度的鬼臼毒素便對SGC7901細胞增殖具有抑制作用，20 mg/L的高劑量組鬼臼毒素抑制作用更顯著，72 h后抑制率達到67.79%。

表 1 鬼臼毒素對SGC7901細胞增殖的影響(%)

與對照組相比較，*P<0.05,**P<0.01

3 討 論

鬼臼類植物是一類含有顯著生物活性物質(zhì)的藥用植物,因為其作用顯著，所以具有悠久的應(yīng)用歷史。歷來醫(yī)家均有應(yīng)用鬼臼類植物診治疾病的記載，臨床上主要用于蛇咬傷、癰癤腫毒、跌打損傷、風(fēng)濕筋骨痛及氣管炎等癥[9-11]。

本研究對八角蓮植物的根及根莖進行化合物的提取分離及鑒別。用10倍量的80%乙醇滲漉提取，回收溶劑后，將浸膏用適量水溶解后分別用醋酸乙酯和正丁醇萃取，醋酸乙酯部分采用了硅膠柱層析、反相中低壓層析、柱層析和HPLC等分離純化技術(shù)，從中分離得到3個化合物。并運用質(zhì)譜、核磁共振色譜等手段對化合物結(jié)構(gòu)進行解析，最終確定化合物為4′,5′-二去甲基鬼臼毒素、八角蓮醇和鬼臼毒素。

為探討鬼臼毒素的抗癌活性，本研究以胃癌細胞株SGC-7901細胞為目標(biāo)細胞，通過自制鬼臼毒素，考察了不同濃度的鬼臼毒素對胃癌細胞生長的抑制作用，探討鬼臼毒素是否具有誘導(dǎo)胃癌SGC-7901細胞凋亡的作用。MTT法檢測結(jié)果顯示，不同濃度的鬼臼毒素處理SGC7901細胞24、48和72 h后,鬼臼毒素呈時間與劑量依賴性抑制SGC 7901胃癌細胞生長。低濃度的鬼臼毒素便對SGC7901細胞增殖具有抑制作用，20 mg/L的高劑量組鬼臼毒素抑制作用更顯著，72 h后抑制率達到67.79%。

[1] 陳毓亨.我國鬼臼類植物資源的研究[J].藥學(xué)學(xué)報,1979,14(2):101-107.

[2] 張 杰,周春山,劉 韶,等.小八角蓮化學(xué)成分研究[J].中草藥,2007,38(4):517-518.

[3] 張 杰，周春山，劉 韶，等.鬼臼毒素抗胃癌細胞株SGC-7901作用的實驗研究[J].中南大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2008，33(8):718-719.

[4] 張曉云,倪京滿,喬 華.鬼臼毒素納米脂質(zhì)體抗腫瘤作用的研究[J].中國中藥雜志,2006,31(2):148-150.

[5] Bohlin L,Rositn B.Podophyllotoxin derivatives:drug discovery and development[J].Drug Discovery Today,1996,1(8):343-351.

[6] yothi P,Jagetia G C，Krishnamurthy H.Evaluation of teniposide (VM-26)-induced toxicity on mouse spermatogenesis by flow cytometry[J].Toxicology,2001,163(2/3):163-174.

[7] Imbert T F.Discovery of podophyllotoxins[J].Biochimie,1998,80(3):207-222.

[8] Jackson D E,Dewick P M.Aryltetralin lignans from Podophyllum hexandrum and Podophyllum peltatum[J].Phytochemistry,1984,23(5):1147-1152.

[9] 楊新波.鬼臼毒素抗腫瘤作用研究進展[J].國外醫(yī)藥:植物藥分冊,1996,11(4):158-159.

[10] 夏提古麗·阿不利孜,賈曉光,熊元君,等.八角蓮的研究進展[J].新疆中醫(yī)藥,2010,28(3):69-72.

[11] 趙立春，何 穎，岳桂華.八角蓮屬藥用植物化學(xué)成分及生理活性研究進展[J].中國民族民間醫(yī)藥，2009,11(3):37-39.

Theidentificationoftheactivecomponentofdysosmaversipellisanditseffectonanticanceractivity

ZHANG Yan-jun,FENG Chuan

(School of Medical Devices Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang，Liaoning Province,117004，China)

ObjectiveTo isolate and identify the active component of dysosma versipellis and determine its anticancer activity.MethodsThe percolation，solvent extraction，chromatography and gas chromatography were used to extract and identify the compound and MTT were applied to determine the anticancer activity of podophyllotoxin.ResultsThree compounds are isolated.Mass spectroscopy and nuclear magnetic resonance chromatography were made to analysis the compound structure，which confirmed as 4′,5′-didemethylpodophyllotoxin，dysosmarol and podophyllotoxin.The MTT shows that the proliferation of SGC7901 gastric cancer cells could be inhibited by the podophyllotoxin of different dose at 24，48 and 72 h in the time and dose-dependent manner.ConclusionDysosma versipellis contains the compounds such as 4′,5′-didemethylpodophyllotoxin，dysosmarol and podophyllotoxin， it own inhibitory effect on proliferation of SGC7901.

dysosma versipellis;podophyllotoxin;inhibition of cell proliferation SGC7901

1673-2995(2013)04-0241-04

R284

A

張艷君(1963-)，女(漢族)，工程師，本科.

2013-04-19)

八角蓮為小檗科(Berberidaceae)八角蓮屬(Dysosma)植物八角蓮[Dysosma versipellis (Hance) M.Cheng]的干燥根及根莖，八角蓮性涼，味甘、微苦，有毒，具有清熱解毒、活血散瘀的功能[1-2]。現(xiàn)代藥理研究表明，八角蓮具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒和抗蛇毒等作用[3-4]。其中，鬼臼毒素(podophyllotoxin)類化合物的抗腫瘤作用受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。本實驗對八角蓮藥材進行提取分離純化，對得到的化合物進行結(jié)構(gòu)確證，同時探討鬼臼毒素的抗癌活性。