李 萍，曾常茜

（1.吉林省圖們市人民醫(yī)院內(nèi)科，圖們 133100；2：大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院，大連 116622）

透骨草（Phryma leptostachyaL.var.asiatica Hara）為透骨草科植物的干燥全草入藥，具有清熱解表、活血消腫作用[1]。文獻(xiàn)報道，透骨草提取物對多種腫瘤細(xì)胞增殖有顯著抑制作用[2]。本實驗首次將透骨草提取物作用于人肝癌SMMC-7721細(xì)胞，觀察透骨草提取物對SMMC-7721細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白caspase-9、-3、-7和X連鎖凋亡抑制蛋白（XIAP）蛋白表達(dá)的影響，探討透骨草提取物誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡的分子機制，旨在為透骨草抗肝癌作用的研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑及儀器 人肝癌SMMC-7721細(xì)胞由吉林省腫瘤研究所提供；鼠抗人caspase-9、-3、-7抗體購自Cell Signaling Technology公司，鼠抗人XIAP單克隆抗體、SP免疫組化試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)公司。RPMI 1640、小牛血清和胰蛋白酶為美國Gibco公司產(chǎn)品；藥物采自遼寧金州大黑山，經(jīng)王心毓老先生鑒定為透骨草科植物（Phryma leptostachyaL.var.asiatica Hara）；流式細(xì)胞儀（FACSNANTATE-SETM）為美國BD公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 透骨草提取物制備方法 采取加熱回流提取法，取干燥透骨草50 g，加8倍量75%乙醇，提取2 h，過濾，濾液水浴濃縮成干膏。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) SMMC-7721細(xì)胞培養(yǎng)于10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，在37℃，5%二氧化碳（CO2）的條件下培養(yǎng)。胰酶消化傳代，每2~3 d傳代1次,實驗選用對數(shù)生長期細(xì)胞。

1.2.3 實驗分組 SMMC-7721細(xì)胞生長至對數(shù)生長期，實驗組加入透骨草提取物溶液，終濃度為40.91 μg/mL，對照組加入 RPMI-1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測SMMC-7721細(xì)胞凋亡 分別收集經(jīng)實驗組和對照組的SMMC-7721細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次，用預(yù)冷70%乙醇4℃固定24 h，PBS洗滌2次，制成1 mL細(xì)胞懸液，加入20 U/mL Rnase，37℃水浴1 h，再加入含碘化丙啶（100 μg/mL）染色，4 ℃避光染色 30 min，流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.5 免疫組化法檢測SMMC-7721細(xì)胞Caspase-9、-3、-7和XIAP蛋白表達(dá) 按試劑盒說明進(jìn)行操作。分別收集實驗組和對照組的SMMC-7721細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液涂片，丙酮固定。3%過氧化氫室溫孵育15 min。正常山羊血清室溫孵育15 min。分別與鼠抗人Caspase-9、-3、-7抗體、鼠抗人XIAP抗體37℃孵育2 h，PBS洗3次。與生物素標(biāo)記二抗室溫孵育 15 min，PBS洗3次。與ABC液室溫孵育10 min，PBS洗3次。DAB溶液顯色，蒸餾水沖洗、蘇木素襯染、脫水、封片，顯微鏡下觀察，細(xì)胞核或細(xì)胞漿出現(xiàn)棕色或棕褐色顆粒判斷為陽性細(xì)胞，無棕色染色者為陰性細(xì)胞，計數(shù)200個細(xì)胞并計算陽性細(xì)胞占所有細(xì)胞的比例。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較行單因方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 透骨草提取物對SMMC-7721細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，未用透骨草提取物處理的對照組SMMC-7721細(xì)胞凋亡率為（3.76±1.01）%，而用 40.91 μg/mL透骨草提取物作用 24 h的SMMC-7721細(xì)胞凋亡率為（26.84±1.23）%，兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），見表1。

表1 流式細(xì)胞術(shù)檢測SMMC-7721細(xì)胞凋亡結(jié)果（±s，n＝3）Tab.1 Apoptosis rates of SMMC-7721 cells with flowcytometry（±s，n＝3）

注：與對照組比較，*P<0.05。

組別 凋亡率對照組 3.76±1.0140.91 μg/mL 透骨草提取物處理組 26.84±1.23*

2.2 透骨草提取物對SMMC-7721細(xì)胞Caspase-9、-3、-7和XIAP蛋白表達(dá)的影響 免疫組化方法觀察結(jié)果顯示，未用透骨草提取物處理的對照組SMMC-7721細(xì)胞Caspase-9蛋白高表達(dá)，細(xì)胞漿或細(xì)胞核著棕黃色的細(xì)胞量多，經(jīng)40.91 μg/mL透骨草提取物處理后的SMMC-7721細(xì)胞Caspase-9蛋白表達(dá)明顯降低，細(xì)胞漿或細(xì)胞核著棕黃色的細(xì)胞量少，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理差異顯著（P＜0.05）；未用透骨草提取物處理的對照組SMMC-7721細(xì)胞Caspase-3蛋白高表達(dá)，細(xì)胞漿或細(xì)胞核著棕黃色的細(xì)胞量多，經(jīng)40.91 μg/mL透骨草提取物處理后的SMMC-7721細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)明顯降低，細(xì)胞漿或細(xì)胞核著棕黃色的細(xì)胞量少，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理差異顯著（P＜0.05）；未用透骨草提取物處理的對照組SMMC-7721細(xì)胞Caspase-7蛋白高表達(dá)，細(xì)胞漿或細(xì)胞核著棕黃色的細(xì)胞量多，經(jīng)40.91 μg/mL透骨草提取物處理后的SMMC-7721細(xì)胞Caspase-7蛋白表達(dá)明顯降低，細(xì)胞漿或細(xì)胞核著棕黃色的細(xì)胞量少，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；未用透骨草提取物處理的對照組SMMC-7721細(xì)胞XIAP蛋白低表達(dá)，細(xì)胞漿或細(xì)胞核著棕黃色的細(xì)胞量少，經(jīng)40.91μg/mL透骨草提取物處理后的SMMC-7721細(xì)胞XIAP蛋白表達(dá)明顯增加，細(xì)胞漿或細(xì)胞核著棕黃色的細(xì)胞量多，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表 2。

表2 SMMC-7721細(xì)胞Caspase-9、-3、-7和XIAP蛋白表達(dá)結(jié)果（±s，n＝3）Tab.2 The expression of protein of Caspase-9、-3、-7 and XIAP in SMMC-7721 cells（±s，n＝3）

表2 SMMC-7721細(xì)胞Caspase-9、-3、-7和XIAP蛋白表達(dá)結(jié)果（±s，n＝3）Tab.2 The expression of protein of Caspase-9、-3、-7 and XIAP in SMMC-7721 cells（±s，n＝3）

注：與對照組比較，*P<0.05。

組別 Caspae-9 Caspase-3 Caspae-7 XIAP對照組 51.2±1.9 59.8±2.2 42.6±1.5 11.4±1.040.91 μg/mL 透骨草提取物處理組 14.7±1.2*17.3±1.1*11.2±0.8*43.7±2.3

3 討論

現(xiàn)代研究表明，中醫(yī)藥在防治腫瘤過程中扮演著不可替代的角色[3-4]。中藥物抗腫瘤的活性與藥物引起腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡密切相關(guān)[5-7]。本實驗將透骨草提取物作用于SMMC-7721細(xì)胞，結(jié)果表明SMMC-7721細(xì)胞凋亡率顯著高于對照組，說明透骨草提取物可誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡。

Caspases是以天冬氨酸為底物的半胱氨酸蛋白酶，在細(xì)胞凋亡調(diào)控過程中具有重要作用[8-9]。當(dāng)細(xì)胞在損傷因素作用或接受凋亡信號時，促使細(xì)胞色素C從線粒體中釋放出來并與凋亡酶激活因子-1結(jié)合，形成多聚體，并促使Caspase-9前體與其結(jié)合形成凋亡小體，導(dǎo)致Caspase-9被激活，激活的Caspase-9再激活Caspase-3、-7，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[10]。本研究結(jié)果表明40.91 μg/mL透骨草提取物處理SMMC-7721細(xì)胞 24 h后，Caspase-9、-3、-7蛋白表達(dá)水平與對照組相比顯著下降，說明透骨草提取物可能通過激活Caspase級聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡。

XIAP是最有效的內(nèi)源性Caspases抑制因子，其在多種腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)[11]。XIAP抑制細(xì)胞凋亡的機制主要是XIAP的BIR2結(jié)構(gòu)域與Caspase-3、Caspase-7結(jié)合，而XIAP的BIR3結(jié)構(gòu)域與Caspase-9結(jié)合，從而抑制細(xì)胞凋亡[12]。本研究結(jié)果表明40.91 μg/mL透骨草提取物處理SMMC-7721細(xì)胞24 h，XIAP蛋白表達(dá)水平與對照組相比顯著增高，說明透骨草提取物通過抑制XIAP，進(jìn)而通過Caspase級聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡。

總之，透骨草提取物能通過XIAP/Caspase信號通路誘導(dǎo)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡，透骨草提取物是否通過其他的凋亡相關(guān)蛋白誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡,有待進(jìn)一步深入研究。

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