胡 奎，王 凡，江 慧，陳 然，李 黎，方 洋，李俊凱 (長江大學農(nóng)學院，湖北 荊州 434025)

不同前處理方法測定小飛蓬植株中莽草酸含量比較

胡 奎，王 凡，江 慧，陳 然，李 黎，方 洋，李俊凱 (長江大學農(nóng)學院，湖北 荊州 434025)

施用草甘膦后雜草體內(nèi)莽草酸的含量可作為檢測雜草對草甘膦抗性水平的重要指標，但樣品的前處理方法對測定結(jié)果具有一定的影響。以小飛蓬(ConyzaCanadensisL.Crong)為材料，設(shè)計了液氮速凍干燥研磨、常溫勻漿和高溫(120℃)殺青后真空干燥研磨3種樣品前處理方法處理小飛蓬樣品，用鹽酸提取莽草酸，經(jīng)高碘酸、氫氧化鈉、甘氨酸顯色，在380nm下測定光密度。3種前處理方法平行30次測定莽草酸含量平均值分別為563.3507、462.8153、888.1420μg/g，在5%水平上，3種處理具有顯著差異。各處理標準誤的大小分別為13.7343、23.7483、30.1076。液氮速凍干燥研磨前處理方法測定結(jié)果標準誤小，準確度高，可作為莽草酸法檢測雜草對草甘膦抗性水平中推薦的樣品前處理方法。

草甘膦；莽草酸；小飛蓬(ConyzaCanadensisL.Crong)；抗性

小飛蓬(ConyzaCanadensisL.Crong)為菊科飛蓬屬越年生或一年生草本植物，又稱祁州一支蒿、蛇舌草、竹葉艾、苦蒿等，原產(chǎn)于北美洲，現(xiàn)已遍布全球溫帶地區(qū)，入侵我國后在各地均有分布，是我國分布最廣的入侵物種之一。2005年，宋小玲等[1]在我國浙江寧波發(fā)現(xiàn)抗草甘膦的小飛蓬。隨著抗草甘膦作物的推廣，草甘膦用量逐漸增加，但由于抗草甘膦雜草的出現(xiàn)和抗性日益嚴重，給草甘膦的應(yīng)用帶來了巨大挑戰(zhàn)，雜草對草甘膦的抗性監(jiān)測成為科學應(yīng)用草甘膦的關(guān)鍵之一。草甘膦競爭性抑制莽草酸途徑的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphatesynthase，簡稱EPSP)的活性[2]，EPSP是植物和微生物體內(nèi)芳香族氨基酸(包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等)生物合成過程中的一個關(guān)鍵酶，催化由莽草酸-3-磷酸酷和磷酸烯醇式丙酮酸形成5-烯醇式丙酮酸基-莽草酸-3-磷酸酯的反應(yīng)。當EPSP受到抑制時，此反應(yīng)便被切斷，導致EPSPS脫磷酸化底物莽草酸的大量積累[3-4]。

目前，測定雜草對草甘膦抗性的方法中莽草酸法主要依據(jù)草甘膦處理植株后，引起敏感植株體內(nèi)莽草酸大量積累，而抗草甘膦雜草體內(nèi)莽草酸的積累量則明顯低于敏感植株[5]。施用草甘膦后雜草體內(nèi)莽草酸的含量可作為檢測雜草對草甘膦抗性水平的重要指標[6]。在測定過程中，樣品的前處理方法與測定結(jié)果關(guān)系密切，本研究通過設(shè)計不同前處理方法，進行小飛蓬植株中莽草酸含量的測定，以為建立雜草對草甘膦抗性監(jiān)測方法提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器及試劑

小飛蓬植株采自湖北省荊州市荊州區(qū)松柏村；主要儀器有紫外可見分光光度計、冷凍干燥機、低溫離心機、烘箱、超聲波洗凈儀；藥劑莽草酸(標樣)、高碘酸、氫氧化鈉、鹽酸、甘氨酸等均為市售分析純。

表1 各處理小飛蓬體內(nèi)莽草酸含量測定結(jié)果 μg/g

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品準備

采集12葉期左右長勢一致的小飛蓬植株頂端部分，置于預(yù)先準備好的碎冰中帶回實驗室，剪取小飛蓬葉片于托盤內(nèi)，并充分混勻。用千分之一的天平準確稱取90份小飛蓬樣品，每份0.5g。

1.2.2 樣品處理

液氮處理：取30份樣品，直接加液氮速凍，研磨至粉末狀。

常溫勻漿：另取30份樣品，在常溫下研磨勻漿。

高溫殺青處理：將30份樣品置于預(yù)先升溫至120℃的烘干箱內(nèi)10min，取出樣品，并放入冷凍干燥機內(nèi)真空干燥，約3h后取出研磨至粉末狀。

1.2.3 莽草酸的提取及含量測定

參照Gaitonde等[7]、婁遠來等[8]的方法，將1.2.2中各處理的所有樣品轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，加入1ml 0.25mol/L HCl輕輕震勻，浸提1h后超聲波輔助提取15min。4℃離心(12000r/min，15min)，上清液置4℃保存待測。

稱取莽草酸標準樣品0.0100g溶于1ml 0.25 mol/L HCl中，分別取0、2、5、10、25、40、50μl于試管中，加0.25mol/L HCl至1ml，加1%高碘酸2ml混合搖勻后，放置室溫下反應(yīng)，3h后加入2ml氫氧化鈉和1.2ml 0.1mol/L甘氨酸分次搖勻后，在380nm處測量并記錄光密度值，通過回歸分析建立莽草酸標準曲線方程。

取待測樣品上清液50μl，按上述相同步驟測光密度，并換算成莽草酸含量。

2 結(jié)果與分析

將用紫外可見分光光度計在380nm處測定各樣品的光密度值，換算成相應(yīng)的莽草酸含量，結(jié)果見表1。不同處理小飛蓬體內(nèi)莽草酸含量測定結(jié)果的標準誤分析見表2。結(jié)果顯示，液氮處理組的標準誤最小，而高溫殺青處理組的標準誤最大，在5%水平上，各處理間差異顯著，1%水平上，高溫殺青處理組與其它兩個處理差異極顯著。

表2 不同前處理方法測定莽草酸含量結(jié)果標準誤分析表

3 討論與小結(jié)

本研究中，液氮處理組標準誤小，可能是液氮速凍降低了植株體內(nèi)相關(guān)酶的活性，保證了各物質(zhì)的含量相對穩(wěn)定。高溫殺青處理組的測定結(jié)果偏高，可能是高溫導致莽草酸的下游化合物烯醇式丙酮酰莽草酸磷酸分解，導致測定結(jié)果顯著高于其他處理。但具體是什么原因?qū)е聹y定結(jié)果偏高，還需要進一步研究。

3種前處理方法中，液氮處理后進行研磨提取測定小飛蓬植株中莽草酸含量，標準誤最小，測定結(jié)果準確，可作為莽草酸法檢測雜草對草甘膦抗性水平方法中推薦的樣品前處理方法。

[1]SONG X L，WU J J，QIANG S.Establishment of a Test Method of Glyphosate-resistantConyzaCanadensisin China[A].The 20th Asian-Pacific Weed Science Society Conference[C].Ho Chi Ming City：Agriculture Publishing House，2005：499-504.

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[7]Gaitonde M K，Gordon M W.A microchemical method for the detection and determination of shikimic acid[J].Journal of Biological Chemistry，1958，230：1043-1050.

[8]婁遠來，鄧淵鈺，沈晉良，等.甲磺隆和草甘膦對空心蓮子草乙酰乳酸合酶活性和莽草酸含量的影響[J].植物保護學報，2005，32(2)：185-188.

2013-06-10

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201303031);國家自然科學基金項目(30971948)。

胡 奎(1989-)，男，碩士生，研究方向為農(nóng)藥學。

[作者簡介]李俊凱，E-mail:junkaili@sina.com。

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1673-1409(2013)23-0007-03