江 兵，徐智勇 ，王安素， 劉 蘇

(1 遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 眼科，貴州 遵義 563099 ；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 眼科，重慶 400010)

晚期糖基化終末產(chǎn)物對(duì)糖尿病結(jié)膜松弛癥的影響

江 兵1，徐智勇2，王安素1， 劉 蘇2

(1 遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 眼科，貴州 遵義 563099 ；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 眼科，重慶 400010)

目的測(cè)定晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)在糖尿病結(jié)膜松弛患者結(jié)膜組織及血清中的含量，探討其在糖尿病結(jié)膜松弛癥發(fā)生過(guò)程中的作用機(jī)制。方法共收集結(jié)膜標(biāo)本36份(糖尿病結(jié)膜松弛癥6例9眼、單純結(jié)膜松弛癥5例9眼、糖尿病不伴結(jié)膜松弛癥者9例9眼和正常人9例9眼)，血清標(biāo)本29份(每人靜脈采血),采用競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(ELISA)定量測(cè)定其AGEs含量。結(jié)果在糖尿病結(jié)膜松弛組、糖尿病組兩組血清AGEs含量(ng/ml)分別為17.5525± 4.1593和15.7092±3.1896，明顯高于結(jié)膜松弛組和正常結(jié)膜組的12.0809± 3.2551和9.0161± 2.4255，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在糖尿病結(jié)膜松弛組與糖尿病組、結(jié)膜松弛組與正常結(jié)膜組病組，血清AGEs含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P= 0.089)。結(jié)膜組織中AGEs含量在糖尿病結(jié)膜松弛組(0.4240 ± 0.0903)、糖尿病組(0.3436 ± 0.0780)、結(jié)膜松弛組(0.2682 ± 0.0410)、正常結(jié)膜組(0.1895 ± 0.0176)依次降低，各個(gè)組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論血清及結(jié)膜中AGEs水平升高與糖尿病結(jié)膜松弛癥密切相關(guān)，高糖環(huán)境和AGEs蓄積可能在糖尿病結(jié)膜松弛的發(fā)生和發(fā)展中起到重要作用。

結(jié)膜松弛癥；糖尿?。煌砥谔腔K末產(chǎn)物

結(jié)膜松弛癥是由于球結(jié)膜過(guò)度松弛,造成松弛的球結(jié)膜堆積在眼球與下瞼緣、內(nèi)、外眥部之間形成皺褶,引起眼表異常的一組疾病[1]。常發(fā)生在老年人[2]，有人發(fā)現(xiàn)用藥物治療降眼壓的青光眼患者結(jié)膜松弛癥發(fā)病率較高[3]，也可見(jiàn)于二尖瓣脫垂綜合癥患者[4]。在臨床眼表疾病的診治過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)很多糖尿病患者出現(xiàn)干澀、異物感等癥狀，部分合并球結(jié)膜松弛。迄今為止關(guān)于結(jié)膜松弛癥的病因及發(fā)病機(jī)制尚無(wú)一種公認(rèn)的理論，有研究認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制可能與氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡及炎性介質(zhì)介導(dǎo)的炎性反應(yīng)等有關(guān)[5-6]。研究表明AGEs濃度的升高與糖尿病及其并發(fā)癥密切相關(guān)[7]，本研究通過(guò)對(duì)糖尿病結(jié)膜松弛患者血清及結(jié)膜中晚期糖基化終末產(chǎn)物的含量進(jìn)行研究，探討其在糖尿病結(jié)膜松弛癥中可能的致病機(jī)理。

1 資料與方法

1.1 試劑 人糖基化終末產(chǎn)物(AGE)ELISA試劑盒(Uscn 美國(guó))。

1.2 標(biāo)本收集與分組 收集2007年1月至2007年12月、重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院眼科門(mén)診和住院的患者共29例(36眼)，按照1999 WTO 糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)和張興儒眼結(jié)膜松弛的臨床分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[8]分成如下四組。糖尿病結(jié)膜松弛組：結(jié)膜松弛程度Ⅲ級(jí)-Ⅳ級(jí)同時(shí)合并2型糖尿病的患者6例(9只眼)，其中男2例，女4例，平均年齡64.34±7.54歲，結(jié)膜松弛癥病程2～4年,糖尿病病程3～10年。結(jié)膜松弛組：結(jié)膜松弛程度Ⅲ級(jí)-Ⅳ級(jí)，不伴有其他疾病的患者5例(9只眼)，男性2例，女性3例，平均年齡71.20±8.03歲，結(jié)膜松弛病程8個(gè)月～6年。糖尿病組：年齡、病程與糖尿病結(jié)膜松弛組相匹配的2型糖尿病合并白內(nèi)障需要行手術(shù)治療患者9例(9只眼)。正常結(jié)膜組：年齡與前兩組相匹配的年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者9例(9只眼)，均無(wú)其它眼疾患及全身疾病。

空腹靜脈血標(biāo)本1000轉(zhuǎn)/ min離心5 min，取上清液500 μL放入-80 ℃低溫冰箱待檢。

糖尿病結(jié)膜松弛組和結(jié)膜松弛組患者，用平鑷將松弛的球結(jié)膜自角膜緣向內(nèi)眥及下方穹隆輕壓撫平，在距離角膜緣6～7 mm處提鉗夾捏提起球結(jié)膜組織，估計(jì)欲切除的多余結(jié)膜組織量。新月形剪切除下方松弛多余結(jié)膜組織作為測(cè)量組織中AGEs的實(shí)驗(yàn)標(biāo)本，8-0可吸收縫線間斷縫合結(jié)膜切口并固定于結(jié)膜切口下淺層鞏膜。糖尿病組和正常結(jié)膜組的患者，行囊外白內(nèi)障摘除手術(shù)過(guò)程中沿手術(shù)切口部位取對(duì)應(yīng)部位球結(jié)膜(取材前均征得患者書(shū)面同意)。球結(jié)膜組織取下后立即電子天平稱重，錫箔紙包裹放入密閉玻璃瓶中置于-80 ℃冰箱。待球結(jié)膜標(biāo)本搜集齊后，加入低溫PBS倍比稀釋，低溫超聲組織破碎，冷凍離心機(jī)(Z 233MK-2 Sigma)8250轉(zhuǎn)/ min、4 ℃ 冷凍離心15 min后取上清液200 μL放入-80 ℃冰箱待檢。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 采用競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(ELISA)測(cè)定AGEs，結(jié)果以ELX800型自動(dòng)酶標(biāo)檢測(cè)儀測(cè)定450 nm處吸光度值，計(jì)算AGEs在血清和組織中的水平。嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

2.1 血清中糖基化終末產(chǎn)物含量 AGEs在糖尿病結(jié)膜松弛組、糖尿病組兩組血清中含量明顯高于結(jié)膜松弛組、正常結(jié)膜組血清AGEs含量，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。糖尿病結(jié)膜松弛組與糖尿病組之間，結(jié)膜松弛組與正常結(jié)膜組之間血清AGEs含量卻沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

組別例數(shù)AGEs糖尿病結(jié)膜松弛組617.5525±4.1593結(jié)膜松弛組512.0809±3.2551b糖尿病組915.7092±3.1896正常結(jié)膜組99.0161±2.4255b

注：b：與糖尿病結(jié)膜松弛組比較，P<0.05。

2.2 結(jié)膜組織中糖基化終末產(chǎn)物含量 糖尿病結(jié)膜松弛組、糖尿病組、結(jié)膜松弛組、正常結(jié)膜組4個(gè)組球結(jié)膜組織中AGEs含量依次降低，各個(gè)組間差異都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

組別AGEs糖尿病結(jié)膜松弛組0.4240±0.0903糖尿病組0.3436±0.0780b結(jié)膜松弛組0.2682±0.0410c正常結(jié)膜組0.1895±0.0176d

注：b：與糖尿病結(jié)膜松弛組比較，P<0.05；c：與糖尿病結(jié)膜松弛組比較，P<0.05；d：與糖尿病結(jié)膜松弛組比較，P<0.05。

3 討論

晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)是在沒(méi)有酶參與的條件下，蛋白質(zhì)、脂類、核酸等生物大分子物質(zhì)自發(fā)地與葡萄糖及其它還原糖反應(yīng)產(chǎn)生的共價(jià)加成物[9]。非酶促糖基化反應(yīng)在正常機(jī)體即緩慢進(jìn)行，其形成的AGEs不可逆，AGEs水平隨年齡增長(zhǎng)而緩慢增加。Pamplona等[10]研究證實(shí)，持久的高血糖會(huì)導(dǎo)致人體內(nèi)許多核酸蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白發(fā)生非酶促糖基化，形成不可逆的晚期糖基化終產(chǎn)物。在糖尿病持續(xù)高血糖情況下，這一反應(yīng)的速度顯著加快，AGEs形成量明顯增多。本研究發(fā)現(xiàn)血清AGEs含量在糖尿病結(jié)膜松弛組、糖尿病組兩組中顯著高于結(jié)膜松弛組、正常結(jié)膜組，與Pamplona等研究相符。

現(xiàn)代組織學(xué)研究證實(shí)結(jié)膜固有層有I型膠原纖維和Ⅲ型膠原蛋白構(gòu)成的網(wǎng)狀纖維和彈力纖維等細(xì)胞間質(zhì)成分。膠原是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)通過(guò)AGE修飾形成分子內(nèi)共價(jià)交聯(lián)的基質(zhì)蛋白。有研究發(fā)現(xiàn)，在高糖環(huán)境下，葡萄糖分子迅速與膠原分子中賴氨酸和羥基賴氨酸的ε氨基發(fā)生非酶糖基化反應(yīng)生成AGEs，并且膠原發(fā)生糖基化后其生物和物理特性均發(fā)生了變化，不易被酶和酸所降解。在非酶糖基化反應(yīng)的過(guò)程中，體內(nèi)的還原性谷胱甘肽、VitE、Vitc的水平顯著降低，還引發(fā)膠原的合成障礙。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在糖尿病患者結(jié)膜組織中AGEs異常升高，表明其結(jié)膜中膠原質(zhì)和量可能發(fā)生了改變。Daniel Meller認(rèn)為膠原纖維的溶解可能是導(dǎo)致結(jié)膜松弛癥的病理過(guò)程，彈力纖維的變性可能是造成結(jié)膜松弛癥形成的病理生理學(xué)說(shuō)[11]。糖尿病患者結(jié)膜固有層中的膠原在高血糖環(huán)境下發(fā)生非酶糖基化反應(yīng)導(dǎo)致結(jié)膜組織中AGEs增多、膠原變性及膠原合成減少，網(wǎng)狀纖維和彈力纖維也會(huì)發(fā)生變性和減少，促使糖尿病患者結(jié)膜松弛的發(fā)生。

AGEs具有廣泛的致病作用。AGEs形成后引起蛋白質(zhì)分子間廣泛交聯(lián)可從多個(gè)方面影響機(jī)體，如引起血管通透性增大、血管基膜增厚和細(xì)胞外基質(zhì)積聚等[12-13]。糖尿病患者結(jié)膜血管通透性增加后血液中的AGEs更多的進(jìn)入結(jié)膜組織中。近期研究表明，人血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上表達(dá)多種特異性的AGEs受體(RAGE)，AGEs與RAGE結(jié)合后可引發(fā)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激、亞鐵血紅素加氧酶1的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄因子(NF一κB)的激活，同時(shí)還可進(jìn)一步增強(qiáng)AGEs受體表達(dá)，引起持續(xù)的細(xì)胞損傷和功能紊亂14]。此外，AGEs在組織中的水平還與RAGE在組織分布的特異性有關(guān)。有研究[15]顯示，糖尿病患者體內(nèi)成纖維細(xì)胞膜上RAGE持續(xù)高表達(dá)。在糖尿病患者結(jié)膜固有層中成纖維細(xì)胞膜上RAGE可能持續(xù)高表達(dá)，結(jié)膜組織中AGEs水平也增高。本實(shí)驗(yàn)中糖尿病結(jié)膜松弛患者結(jié)膜組織中AGEs含量明顯高于其他三組，可能與血糖水平高、結(jié)膜組織固有層膠原相對(duì)豐富、血管通透性增加以及結(jié)膜組織中成纖維細(xì)胞膜上RAGE持續(xù)高表達(dá)有關(guān)。有人將大鼠尾鍵膠原與葡萄糖或核糖混合孵育7周，發(fā)現(xiàn)膠原纖維間的距離加大，認(rèn)為與AGEs與RAGE結(jié)合后可引發(fā)氧化應(yīng)激有關(guān)。該現(xiàn)象與糖尿病結(jié)膜松弛中膠原變化極為相似。我們推測(cè)結(jié)膜組織AGEs與RAGE結(jié)合后，導(dǎo)致氧化應(yīng)激，細(xì)胞損傷，進(jìn)而引起糖尿病結(jié)膜松弛的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)中糖尿病無(wú)結(jié)膜松弛患者結(jié)膜組織中AGE較單純結(jié)膜松弛患者高，可能糖尿病患者體內(nèi)RAGE高表達(dá)有關(guān)。對(duì)于單純結(jié)膜松弛癥AGE低于無(wú)結(jié)膜松弛癥的糖尿病，提示結(jié)膜松弛除與AGEs有關(guān)，可能還有其他致病因素，如Li等[16]報(bào)道了結(jié)膜松弛癥與基質(zhì)金屬蛋白酶的過(guò)度表達(dá)和增生活躍有關(guān)。

葡萄糖濃度升高，使血清、球結(jié)膜組織中的AGEs異常增加，AGEs在結(jié)膜組織中蓄積，AGEs對(duì)結(jié)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的損害、固有層膠原糖基化、氧化應(yīng)激損傷等，導(dǎo)致結(jié)膜組織細(xì)胞賴以生存的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生相應(yīng)的改變，同時(shí)引起結(jié)膜組織細(xì)胞生存的微環(huán)境理化性質(zhì)的紊亂，促使糖尿病結(jié)膜松弛的發(fā)生、發(fā)展。

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Effectofadvancedglycationendprodutsindiabeticconjunctivochalasis

Jiangbing,Xuzhiyong,Wangansu,Liusu

(1.Department of Ophthalmology，The Affiliated Hospital of Zunyi Medical University，Guizhou Zunyi 563099,China;2.Department of Ophthalmology，The Affiliated Second Hospital，Chongqing Medical University，Chongqing 400010，China)

ObjectiveThis study was to investigate the level and role of AGEs in diabetic conjunctivochalasis.MethodsThe levels of AGEs were assessed by competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in 36 conjunctive tissue samples and 29 serum samples which were collected from the patients with diabetic conjunctivochalasis (9 eyes of 6 cases), only conjunctivochalasis (9 eyes of 5 cases), diabetes without conjunctivochalasis (9 eyes of 9 cases) and normal subjects

extracapsular extraction (9 eyes of 9 cases).ResultsMean levels of serum AGEs (ng/mL) in diabetic conjunctivochalasis and diabetes were 17.5525±4.1593 and 15.7092±3.1896, showing a significantly higher level than those of only conjunctivochalasis group and normal conjunctiva group (12.0809±3.2551, 9.0161±2.4255) (P<0.05). There was no statistically significant difference in the level of serum AGEs in diabetic conjunctivochalasis group and diabetes group(17.5525±4.1593 vs 15.7092±3.1896), conjunctivochalasis group and normal conjunctival group (12.0809±3.2551 vs 9.0161±2.4255).The levels of AGEs (ng/mg) in conjunctive tissue decreased gradually in diabetic onjunctivochalasis group(0.4240±0.0903)， in diabetes group(0.3436±0.0780)，conjunctivochalasis group(0.2682±0.0410) and normal conjunctival group(0.1895±0.0176). There was statistically significant difference in the level of AGEs in conjunctive tissue between any two group (P<0.05).ConclusionThe higher levels of AGEs in serum and conjunctival tissue were closely correlated with diabetic conjunctivochalasis. High glucose and AGEs accumulation may play a critical role during the occurrence and development of diabetic conjunctivochalasis。

conjunctivochalasis;diabetes;aadvanced glycosylation end products

重慶市教委科學(xué)技術(shù)研究基金項(xiàng)目(NO：KJ060319)。

R544.1

A

1000-2715(2013)05-0449-04

[收稿2013-06-15;修回2013-08-17]

(編輯：譚秀榮)