李龍萍, 匡小燕,鄧 飛

(1.貴陽(yáng)市第五人民醫(yī)院 病理科，貴州 貴陽(yáng) 550004，2.遵義醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校附屬醫(yī)院 病理科，貴州 遵義 563002，3.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴州 遵義 563099)

非霍奇金淋巴瘤中p16基因突變與MSI的關(guān)系

李龍萍1, 匡小燕2,鄧 飛3

(1.貴陽(yáng)市第五人民醫(yī)院 病理科，貴州 貴陽(yáng) 550004，2.遵義醫(yī)藥高等專科學(xué)校附屬醫(yī)院 病理科，貴州 遵義 563002，3.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴州 遵義 563099)

目的研究p16基因突變與微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(Microsatellite instability MSI) 在非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin’s lymphoma NHL)發(fā)生發(fā)展中的作用，探討p16基因內(nèi)外顯子1、2(exon1、exon2)的分子遺傳學(xué)改變與非霍奇金淋巴瘤的關(guān)系。方法采用PCR-SSCP法對(duì)40例已確診NHL進(jìn)行p16基因外顯子1、2的突變研究；選取p16基因內(nèi)部微衛(wèi)星位點(diǎn)D9S265，D9S259，D9S161，D9S169對(duì)MSI進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果40例NHL中，P16基因總突變率為35.0%(14/40)，位點(diǎn)D9S161、D9S259的MSI組的P16的突變率明顯高于MSI陰性組，而D9S265和D9S169則與之相反(P>0.05),D9S259、D9S161、D9S265外顯子2的突變和缺失率均高于外顯子1。結(jié)論①NHL中存在較高p16基因突變率和MSI，提示其突變和MSI可能參與NHL的發(fā)生、發(fā)展；②通過統(tǒng)計(jì)分析，微衛(wèi)星位點(diǎn)的MSI主要影響p16基因外顯子2的突變和缺失；③微衛(wèi)星位點(diǎn)D9S161和D9S169與p16基因的關(guān)系較緊密。

非霍奇金淋巴瘤；p16基因；微衛(wèi)星不穩(wěn)定性

非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin’s lymphoma NHL)是淋巴造血系統(tǒng)中一種常見的惡性腫瘤,占所有淋巴瘤的80%～90%[1]。我國(guó)NHL發(fā)病率和死亡率約占全部惡性腫瘤的3%～5%，為惡性腫瘤第八位[2]。其發(fā)病率近20多年來在世界各國(guó)明顯上升, 但是近年來，淋巴瘤腫瘤細(xì)胞微衛(wèi)星的表達(dá)逐漸引起了人們的注意。研究證實(shí)，某些染色體的單純易位并不能導(dǎo)致惡性表型，可能有其他因素的協(xié)同作用，微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(Microsatellite instability MSI)可能是其中因素之一。抑癌基因位點(diǎn)附近常頻發(fā)微衛(wèi)星DNA不穩(wěn)定性的改變[3]。在非霍奇金淋巴瘤中，有關(guān)p16基因外顯子1、2及其附近/內(nèi)部微衛(wèi)星位點(diǎn)MSI的研究與兩者相關(guān)性研究國(guó)內(nèi)外尚無報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 資料來源 來自遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科2004年4月至2007年12月的各型NHL擋案材料40例, 按2001年WHO分類[4]淋巴造血組織腫瘤分類，所有病例經(jīng)病理組織學(xué)及免疫組織化學(xué)檢查確診。按細(xì)胞來源分:T和NK細(xì)胞腫瘤13例,B細(xì)胞腫瘤27例;按生物學(xué)分:惰性組4例,侵襲性組32例,高侵襲性組4例，所有標(biāo)本均為4%福爾馬林固定,石蠟包埋的組織。

1.2 石蠟組織DNA 提取 提取DNA主要試劑購(gòu)于上海生工生物技術(shù)有限公司。組織塊大且壞死少者常規(guī)脫蠟后采用常規(guī)蛋白酶K消化,酚—氯仿—異戊醇抽提,鹽沉淀法提取石蠟組織DNA ,反之用粗提法:常規(guī)脫蠟后加入裂解液和蛋白酶K55 ℃過夜,待組織溶解后滅活蛋白酶K,吸上清液做PCR模板。核酸測(cè)定儀上測(cè)定DNA濃度及比值A(chǔ)260/ A280 ,比值<1.6者棄用重提。

1.3 p16基因突變分析

1.3.1 p16 exon1、exon2DNA引物序列及擴(kuò)增DNA的長(zhǎng)度(見表1)。

選取p基因內(nèi)部微衛(wèi)星位點(diǎn)多態(tài)標(biāo)記4個(gè)。引物序列、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度(見表2)。

表1 p16 exon1、exon2DNA引物序列及所擴(kuò)增的DNA的長(zhǎng)度

PrimerspecifityPrimerSequence(5’—3’) Lenghofproduct(bp)AnnealingTemperature(℃)exon1P1GGAGCAGCATGGAGCCGP2AGTCGCCCGCCATCCCCT20358exon2aP1CTGGCTCTGACCATTCTGTP2AGCACCACCAGCGTGTCC17158exon2bP1GACCCCGCCACTCTCACCP2AGGTACCGTGCGACATCGC17059exon2cP1GATGCCTGGGGCCGTCTP2CAGGGTACAAATTCTCAGAT16955

注：P1:indicates forward; P2:indicates reverse。

表2 p16基因內(nèi)部微衛(wèi)星位點(diǎn)序列及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度

LocusBandPrimerSequence AlleleSizeD9S2659p21-9p21TGGTGAAGCCTATTCTTGGTCATTGGCAAAGTGTGCG88-90D9S2599p21-9p21GGCATCATTGCNCCATGGATGGATCTTATGGGTGGAA138-138D9S1619p21-9p21TGCTGCATAACAAATTACCACCATGCCTAGACTCCTGATCC121-133D9S1699p21-9p21AGAGACAGATCCAGATCCCATAACAACTCACTGATTATTTAAG-GC259-269

注：P1:indicates forward; P2:indicates reverse。

p16基因外顯子1、2(exon1、exon2)擴(kuò)增條件：

PCR 反應(yīng)體系為50μL,其中10×Buffer 5μL，MgCl2(25 mmol/L)1.8～2.5 μL,0.5 μM上游及下游引物，dNTP(dATP,dCTP,dGTP,dTTP,10 mM each)1 μL,基因組DNA 3 μL，Taq酶2U，不足50 μL的加超純水補(bǔ)足。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，于4 min時(shí)加Taq酶；94 ℃變性45 s；退火 1min；72 ℃延伸1 min,72 ℃后延伸5 min，4 ℃保存?zhèn)溆?。以雙蒸水代替模板做空白對(duì)照。

D9S265、D9S259、D9S161、D9S169擴(kuò)增條件：

反應(yīng)體系共50 μL，加入10×Buffer5 μL, MgCl2(25 mmol/L) 4 μL，0.5 μM上游及下游引物，dNTP(dATP,dCTP,dGTP,dTTP,10 mM each) 1 μL,基因組DNA 3 μL，Taq酶2U，不足50 μL的加超純水補(bǔ)足。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，于4 min時(shí)加Taq酶，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s,72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。(PTC-100TM)。每組PCR擴(kuò)增設(shè)置無模板對(duì)照(空白對(duì)照)，以超純水代替模板組DNA。引物、10×PCR buffer、dNTP、MgCl2及擴(kuò)增條件等均與研究組相同，以排除基因組DNA污染的可能。

2 結(jié)果

2. 1 p16 基因突變情況 40例NHL中有14例標(biāo)本的p16基因組DNA存在異常遷移率帶(以exon2b為例，見圖1、2) ,表明這些腫瘤可能存在p16基因突變。

2. 2 不同分型NHL中p16突變率 總突變率為35.0%(14/40),T和NK細(xì)胞組和B細(xì)胞組突變率無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),按惰性組、侵襲性組、高侵襲性組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表1、表2)。分析p16外顯子1、2在40例淋巴瘤組織中的突變率(見表4)。

2. 3 四個(gè)位點(diǎn) MSI的總陽(yáng)性率為50.0%(20/40),(見圖3～5)，從表6可知，各位點(diǎn)MSI、頻率介于12.5%～27.5%，其中D9S259位點(diǎn)MSI頻率最高為27.5%,D9S161位點(diǎn)MSI頻率最低為12.5%。

表3 p16基因突變與細(xì)胞來源的關(guān)系

細(xì)胞來源P16基因突變+-合計(jì)T和NK細(xì)胞4913B細(xì)胞101727合計(jì)142640

注：Fisher’s exact test in 2×2table,P=0.972。

表4 p16基因突變與生物學(xué)行為的關(guān)系

生物學(xué)行為P16基因突變+-合計(jì)惰性134侵襲性102232高侵襲性224合計(jì)142640

注：Fisher’s exact test in 2×2table,P=1.000。

2. 4 不同微衛(wèi)星位點(diǎn) MSI與p16突變的相關(guān)性,從表7可知：D9S259位點(diǎn)的MSI陽(yáng)性組p16突變率最高為57.1%。D9S169位點(diǎn)MSI陽(yáng)性組p16突變率最低為27.3%。D9S161和D9S259位點(diǎn)MSI陽(yáng)性組的p16突變率均高于MSI陰性組，而D9S265和D9S169則與之相反(P>0.05)。

表5 p16基因各外顯子在40例非霍奇金淋巴瘤組織中的突變情況

外顯子突變例數(shù)突變率Exon137.5%Exon2a512.5%Exon2b410.0%Exon2c25.0%

表6微衛(wèi)星DNA多態(tài)性標(biāo)記的MSI發(fā)生率

Locusinformationnumberofnon-HodgkinlymphomaMSIcase(percent)D9S265409(22..5%)D9S2594011(27.5%)D9S161405(12.5%)D9S169407(17.5%)

表7 NHL微衛(wèi)星位點(diǎn)MSI與p16總突變的比較

微衛(wèi)星位點(diǎn)p16突變(+)MSI+MSI-PD9S2653/10(30.0%)11/30(36.7%)1.000D9S1613/8(37.5%)11/32(34.4%)1.000D9S2594/7(57.1%)10/33(30.3%)0.214D9S1693/11(27.3%)11/29(37.9%)0.795

注:分子表示p16突變(+)例數(shù),分母表示MSI+或MSI-例數(shù),括號(hào)內(nèi)數(shù)字表示突變率(%),P值采用確切概率法計(jì)算。

2.5 各微衛(wèi)星位點(diǎn)MSI+/MSI-分別對(duì)p16外顯子1和2的影響,由表8可知：在D9S259位點(diǎn)上的MSI陽(yáng)性組中，p16基因exon1與exon2突變和缺失率均為最高，分別為28.6%和57.1%，在D9S259與D9S161位點(diǎn)上外顯子2的突變和缺失率均高于外顯子1。各位點(diǎn)MSI陽(yáng)性組的p16外顯子1、2突變和缺失率與陰性組間比較無顯著性差異(P>0.05)。

表8 NHL各微衛(wèi)星位點(diǎn)MSI與p16exon1-2改變(突變和缺失)的比較

微衛(wèi)星位點(diǎn)exon1突變和缺失MSI+MSI-Pexon2突變和缺失MSI+MSI-PD9S2652/10(20.0%)1/300.1493/10(30.0%)8/301.000D9S1611/6(16.7%)2/340.3943/6(50.0%)8/340.319D9S2592/7(28.6%)1/330.0744/7(57.1%)7/330.142D9S1692/8(25.0%)1/320.0962/8(25.0%)9/321.000

注:分子表示p16突變和缺失例數(shù),分母表示MSI+或MSI-例數(shù),括號(hào)內(nèi)數(shù)字表示突變和缺失率(%)，P值采用確切概率法計(jì)算。

3 討論

p16基因是近年發(fā)現(xiàn)的直接參與細(xì)胞生長(zhǎng)增殖負(fù)調(diào)控的抑癌基因，位居染色體9p21,編碼一個(gè)相對(duì)分子量16 000的多肽[5]，可以在多種腫瘤中發(fā)生失活，在多數(shù)細(xì)胞系中，p16基因等位缺失是其主要的失活機(jī)制[6]，造血系統(tǒng)惡性腫瘤p16基因失活狀態(tài)也受到了人們的關(guān)注,但有關(guān)p16基因失活方式及發(fā)生率的報(bào)道結(jié)果較不一致[7-8]。基因組不穩(wěn)定是腫瘤細(xì)胞的基本特征。基因組不穩(wěn)定有兩種形式，一種是由腫瘤抑制基因(tumor-suppressing gene, TSG)失活引起的腫瘤抑制途徑[9-10]，另一種是由DNA錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)功能缺陷引起復(fù)制錯(cuò)誤型(RER+)[11]，表現(xiàn)為MSI。

目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)MSI在非霍奇金淋巴瘤中的研究報(bào)道不多，有報(bào)道表明近83%的粘膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤(mucous-associated lymphoid tissue Lymphoma, MATL)和100%的胃大淋巴細(xì)胞性淋巴瘤中有一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)MSI，在CD30陽(yáng)性的皮下淋巴組織增生的過程中及淋巴母細(xì)胞淋巴瘤中也檢出MSI，并發(fā)現(xiàn)MSI在腫瘤的轉(zhuǎn)化過程中及某些類型的腫瘤的早期診斷方面有重要作用。

本課題對(duì)40例非霍奇金淋巴瘤進(jìn)行研究，探討腫瘤發(fā)生發(fā)展過程的腫瘤抑制基因途徑和微衛(wèi)星不穩(wěn)定途徑及其兩者之間的關(guān)系，觀察到了：①非霍奇金淋巴瘤中存在p16基因突變和缺失；p16基因的異?？赡軈⑴c了非霍奇金淋巴瘤的發(fā)生與進(jìn)展；②非霍奇金淋巴瘤中存在微衛(wèi)星DNA的不穩(wěn)定性，MSI可能參與了非霍奇金淋巴瘤的發(fā)生與進(jìn)展；③微衛(wèi)星位點(diǎn)D9S169與D9S161可能是p16基因附近與p16基因關(guān)系較密切的微衛(wèi)星位點(diǎn)，即p16基因可能是D9S169與D9S161微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的靶基因。證實(shí)了抑癌基因位點(diǎn)附近常頻發(fā)微衛(wèi)星DNA不穩(wěn)定性的改變。通過檢測(cè)MSI不僅有助早期發(fā)現(xiàn)某些惡性腫瘤和高危人群，而且有助于進(jìn)行早期防治。

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Astudyofp16genemutationsandmicrosatelliteinstabilityinNon-Hodgkin’slymphomas

Lilongping1，Kuangxiaoyan2，Dengfei3

(1.Department of Pathology,The Fifth People’s Hospital of Guiyang City, Guizhou Guiyang 550004，China;2.Department of Pathology,The Affiliated Hospital of Zunyi City Pharmaceutical College, Guizhou Zunyi 563002,China;3.Department of Pathology,The Affiliated Hospital of Zunyi Medical University，Guizhou Zunyi 563099,China)

ObjectiveTo evaluate the role of p16 gene mutation and microsatellite instability(MSI) in pathogenesis of non-Hodgkins lymphomas (NHL),Discussion within the p16 gene exon-l, exon 2 changes in molecular genetics and non-Hodgkin’s Lymphoma relations.Methods40 cases of Non-Hodgkin’s lymphoma have been confirmed for frequency of p16 gene mutation in exon 1 to 2 with PCR-SSCP method; four microsatellite locus (D9S265、D9S259、D9S161、D9S169) whithin the p16 gene were used for analyzing MSI in all cases.ResultsIn 40 cases of Non-HodgKin’s lymphoma, the frequency of p16 genic mutation was 35%(14/40). Compared with the negative group, both D9S161 and D9S259 positive of MSI had a higher point mutation in p16 gene, while the other two loci were on the contrary (P>0.05).Mutation and deletion of D9S259、D9S161、D9S265 exon 2 were higher than the exon-1.Conclusion① High mutation rate of P16 gene and MSI existed in non-HodgKin Lymphomas, it was shown that mutation in p16 gene and MSI might play a key role in the non-Hodgkin LLymphomas.②Through statistical analysis, MSI in the four loci were mainly influenced by mutation and deletion of p16 gene exon 2.③ It could be concluded that the relationship between p16 gene and D9S161, D9S169 were closely related.

non-Hodgkin’s lymphoma;p16 gene;microsatellite instability

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目( NO:30160030)。

鄧飛，男，博士，教授，研究方向：霍奇金淋巴瘤的致病機(jī)理及冶療，E-mail:2323853378@qq.con。

R735.2

A

1000-2715(2013)05-0417-05

[收稿2013-05-17;修回2013-08-12]

(編輯：譚秀榮)