鄧文文，趙然尊，龍仙萍，石 蓓

(遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院 心血管內(nèi)科， 貴州 遵義 563099)

成年小鼠心臟干細胞的體外分離及表型鑒定

鄧文文，趙然尊，龍仙萍，石 蓓

(遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院 心血管內(nèi)科， 貴州 遵義 563099)

目的建立穩(wěn)定的小鼠心臟干細胞(cardiac stem cells，CSCs)分離方法，并對體外培養(yǎng)的CSCs進行生物學特性鑒定。方法選用健康成年CD1小鼠，在無菌條件下取心臟并剪碎，并用II型膠原酶和胰蛋白酶反復消化，采用差速離心法去除混合細胞懸液中的心肌細胞，結(jié)合免疫磁珠分選法純化c-kit+CSCs后，進行流式細胞儀表面標記鑒定。結(jié)果酶消化法和磁珠分選法結(jié)合成功分離并純化了成年小鼠c-kit+CSCs。磁珠分選前，流式細胞儀表面標記鑒定c-kit+CD34-CSCs為4.62%；經(jīng)磁珠分選后c-kit+CD34-CSCs可達70.23%。結(jié)論酶消化法結(jié)合磁珠分選法能成功分離純化成年小鼠c-kit+CSCs，且能用于后續(xù)體外培養(yǎng)。體外培養(yǎng)時c-kit+CSCs相對于其它表型標記的心臟干細胞更加穩(wěn)定，具有較強的擴增能力。相對于心臟組織塊培養(yǎng)法，酶消化法可在短期內(nèi)獲得高純度的c-kit+CSCs，更有助于心臟干細胞相關信號通道的體外實驗研究。

心臟干細胞；細胞分離；酶消化法；磁珠分選法;小鼠

在成年哺乳動物的心臟組織內(nèi)，心臟干細胞數(shù)量較少，分離較為困難[1]。而臨床治療需要大量的CSCs，這就使得CSCs的臨床應用受到極大的限制。迄今為止，CSCs的分離方法甚至不能完全滿足CSCs的相關研究。目前主要有兩種方法用于分離鼠和人CSCs，一種是酶消化法[2]，另一種是原代組織貼壁培養(yǎng)法[3]。最近，S.H.choi及其同事首次證實了，盡管上述兩種方法最終所得到的c-kit+CSCs細胞數(shù)量大致相同，然而，酶消化法所獲得的CSCs具有更高的增殖潛能，更能滿足臨床治療對干細胞數(shù)量的需求，且酶消化法所獲得的CSCs表面的c-kit表達量更高[4]。本課題組經(jīng)過探索已形成較為穩(wěn)定的酶消化法分離CSCs，可為CSCs修復受損心臟的臨床治療策略提供可靠的實踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 隨機選擇清潔級成年CD1小鼠，體重60～100 g，雌雄不限，購自第三軍醫(yī)大學實驗動物中心。

1.2 實驗試劑和藥品 II型膠原酶(Sigma-Aldrich)、0.25%胰蛋白酶(不含EDTA，Hyclone)、DMEM高糖培養(yǎng)基(GBICO)、優(yōu)質(zhì)胎牛血清(Fetal bovine serum, FBS, Hyclone)、青鏈霉素雙抗(索萊寶)、包被羊抗兔二抗的磁珠(Dynal Biotech，M-280)，兔抗小鼠c-kit抗體(Santa Cruz)，PE標記的大鼠抗小鼠c-kit抗體及其同型對照(eBioscience)，F(xiàn)ITC標記的大鼠抗小鼠CD34抗體及其同型對照(eBioscience)，小鼠白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor, LIF, Sigma-Aldrich)，小鼠堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF, Sigma-Aldrich)，小鼠表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF, Sigma-Aldrich)，無鈣鎂的PBS緩沖液(Cambrex)。

1.3 主要實驗儀器 超凈臺(蘇州蘇潔凈化)，數(shù)顯恒溫水浴箱(上海喬躍)，離心機(Thermo )，垂直混合儀(寧波新芝)，磁力架(Dynal Biotech)，CO2孵育箱(Thermo )，倒置相差顯微鏡(Olympus)，流式分選儀(BD)。

1.4 細胞分離 采用酶消化法結(jié)合磁珠分選法分離c-kit+ CSCs。方法如下：首先，小鼠全身肝素化后行頸椎脫臼處死，用75%酒精進行浸泡消毒，在超凈臺中迅速取出心臟。用不含鈣鎂離子的PBS反復沖洗心臟，去除心腔內(nèi)的余血。在無血清高糖DMEM培養(yǎng)基中迅速充分剪碎心臟。其次，將剪碎的心臟組織碎塊置于玻璃搖瓶中，加入含0.05%Ⅱ型膠原酶和 0.05% 胰蛋白酶的PBS 10 mL，恒溫37 ℃不斷搖晃消化。待瓶中的心臟組織塊呈白色纖維狀時停止消化。在超凈臺內(nèi)用吸管輕輕吹打消化后的細胞懸液，用細胞篩過濾懸液以去除未被消化的心肌組織及部分心肌細胞，收集過濾后的細胞懸液，以500 rpm 離心3 min，輕柔取上清以1 500 rpm離心10 min，棄上清，利用細胞不同的沉降系數(shù)，進一步去除細胞懸液中的心肌細胞。加入含1%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基重懸細胞沉淀物，并進行細胞計數(shù)。隨后，在細胞懸液中加入兔抗大鼠c-kit抗體(根據(jù)細胞計數(shù)決定所加抗體的量，1∶250)，并置于垂直混合儀上4 ℃旋轉(zhuǎn)孵育1 h，離心，棄上清并重懸，隨后用羊抗兔二抗包被的2.8 μm 磁珠(1∶150)孵育細胞懸液，置于垂直混合儀上4 ℃旋轉(zhuǎn)孵育30 min。隨后直接把裝有細胞懸液的離心管置于DYNAL 磁力架中，2～3 min后可見靠近磁力架的管壁有一排棕褐色顆粒，用1mL注射器輕輕快速吸去管中的液體，重懸管壁上的棕褐色顆粒(磁珠為棕褐色)，再將離心管置于磁力架上，重復上一步驟。磁力分選完成后，進行細胞計數(shù)，并用含15%FBS、10 ng/mL LIF、20 ng/mL bFGF、10 ng/mL EGF 和1%青-鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基(mNSCM，即改良神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基)進行培養(yǎng)。

1.5 流式細胞鑒定 分別取未經(jīng)磁珠分選和經(jīng)磁珠分選但未經(jīng)完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的CSCs進行流式細胞鑒定。取約2×106個細胞用無血清的DMEM高糖培養(yǎng)基制成200 μL細胞懸液，分裝成兩管，各100 μL。在一管中加入2 μL PE標記的大鼠抗小鼠c-kit IgG2a抗體和2 μL FITC標記的大鼠抗小鼠CD34 IgG2b抗體，在另一管中加入2 μL PE標記的大鼠抗小鼠同型對照IgG2a抗體和2 μL FITC標記的大鼠抗小鼠同型對照 IgG2b抗體，混勻后置于4 ℃避光孵育90 min，隨后用2 mL PBS洗滌細胞，以1 500 rpm 離心10 min，棄上清，重復洗滌一次。每管中分別加入1%多聚甲醛100μL，吹打混勻，避光后行流式細胞儀檢測。

2 結(jié)果

2.1 細胞形態(tài) 在倒置相差顯微鏡下觀察免疫磁珠分選所得的細胞為圓形、體積小而明亮，直徑為4～10 μm(見圖1A)。

2.2 流式細胞儀鑒定 所采用的鑒定CSCs的方法是通過流式細胞儀檢測其表面標記物。流式細胞分析結(jié)果顯示，未經(jīng)磁珠分選的細胞中表型為c-kit+CD34-的細胞達4.62%(見圖1B)；經(jīng)免疫磁珠分選但未經(jīng)mNSCM培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞中表型為c-kit+CD34-的細胞達70.23%(見圖1C)。

注:A:免疫磁珠分選法分選的心臟干細胞，小而亮，呈圓形，心臟干細胞表面附有數(shù)個小磁珠(×400)； B ：流式細胞儀分析結(jié)果顯示采用酶消化法獲得的細胞在免疫磁珠分選前表型為c-kit+CD34-CSCs達4.62%； C： 流式細胞儀分析結(jié)果顯示采用酶消化法獲得的細胞經(jīng)免疫磁珠分選但未經(jīng)mNSCM培養(yǎng)表型為c-kit+CD34-CSCs達70.23%。 圖1 c-kit+心臟干細胞及其流式細胞鑒定圖

3 討論

急性冠脈綜合征是當今老齡化社會心血管事件的主要死因。缺血性心臟病可引起心肌梗死并減少心肌細胞的數(shù)量。慢性高血壓也可使心肌細胞過度丟失[5]。最新研究表明，年輕人的心肌細胞可再生。心肌細胞再生速率在嬰兒期最高，之后開始下降，在青少年發(fā)育急速期再次升高并持續(xù)到20歲左右[6]。但事實上，冠心病的發(fā)病人群年齡多在40歲左右，其心肌細胞的細胞周期停留在G0期，并不能繼續(xù)增殖[7]。目前，大量研究證實心臟小生境中存在心臟干細胞，其能分化為心肌細胞、內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞[8-9]。體外移植CSCs (cardiac stem cells)可顯著改善惡化的心功能，這主要依賴于CSCs分化形成的新生血管和心肌細胞對受損的心臟具有修復功能[10-11]。最近研究顯示，將外源性心臟干細胞移植至心梗后30 d的大鼠心臟內(nèi)，可激活內(nèi)源性心臟干細胞，從而改善左室功能失調(diào)[12]。此外，心肌梗死小鼠心臟內(nèi)注射心臟球形干細胞后，心臟球形干細胞通過分泌生長因子發(fā)揮旁分泌作用對存活的心肌細胞具有抗凋亡作用[13]。近期的1期臨床試驗結(jié)果也表明，移植自體CSCs可顯著改善缺血性心肌病患者的心功能[14]。總之，CSCs具有直接再生和旁分泌作用，因而被認為是心臟再生治療的最佳干細胞源之一。

心臟干細胞的出現(xiàn)為心肌再生和心肌梗死的治療提供了新的希望。但是，包括CSCs在內(nèi)的成年動物來源的干細胞在體外擴增方面具有局限性，若進行心血管疾病的干細胞治療，必須克服這一問題。目前用于分離心臟CSCs的方法主要有酶消化法和組織塊貼壁培養(yǎng)法。綜合本課題組及其他實驗室報道[2-4]，酶消化法獲得CSCs實驗周期短；而組織塊培養(yǎng)法獲得CSCs周期長，至少2～3周后方可傳代，且所獲得的心臟球形干細胞大多為Sca-1+CSCs?？傊?，CSCs的分離方法中，酶消化法較組織塊貼壁培養(yǎng)法具有更佳的臨床應用前景。

在酶消化法中，酶的選擇和消化條件的控制至關重要。本課題組選用的是0.05% II型膠原酶和0.05% 胰蛋白酶。盡管有研究表明，0.1%膠原酶可使心臟組織中的心肌細胞致死。將心臟組織塊置于37 ℃、0.1%膠原酶作用30min以上，絕大多數(shù)心肌細胞都會死亡[10]。但本實驗臺盼藍染色計數(shù)顯示高濃度的II型膠原酶在強力去除心肌細胞的同時，也使心臟干細胞活力下降甚至死亡。0.05%的低濃度胰蛋白酶消化液對細胞作用適中，且對干細胞表明標記物損傷較小。酶消化溫度需控制在37 ℃，溫度過低消化不充分，過高則會增加胰蛋白酶的毒性從而影響細胞的活力。同時，需不斷地輕輕搖晃，使混合酶液與心臟組織碎塊表面充分接觸，促進消化。酶消化法結(jié)合免疫磁珠分選法可以從細胞混合物中分離出高純度的細胞，具有分離純度高、細胞處理量大及分選速度快的優(yōu)點。在本試驗中，將結(jié)合免疫磁珠的細胞懸液置于Dynal磁力架中2～3 min即可分選出陽性細胞，該磁力架無需附加磁力柱，可在一定程度上縮短分選時間。

本實驗采用流式細胞儀對所獲得的心臟干細胞的細胞表面標記物進行鑒定。但是，目前看來，關于心肌干細胞表面標志物，尤其是較為特異的標志物，意見并不統(tǒng)一。Messina研究發(fā)現(xiàn)，在心肌干細胞培養(yǎng)的早期，它可以表達KDR/flk-1、CD31、c-kit和Sca-1等，隨著細胞的成熟，許多表面標記逐漸消失，c-kit是唯一的不隨細胞成熟而消失的表面標記[3]。c-kit，又稱為CD117或干細胞生長因子受體，表達于CSCs及其它類型干細胞(如骨髓造血干細胞)的胞膜表面。C-kit是一種II型酪氨酸激酶受體，其與干細胞生長因子(SCF)結(jié)合后可促進干細胞的生存、動員和增殖[15]。Anversa比較分析發(fā)現(xiàn)在心肌梗死或缺血/再灌注損傷中與Sca-1+CSCs相比，C-kit+CSCs的心臟修復能力較強[16]。因此，本課題組選取c-kit為心臟干細胞鑒定的主要標記。CD34是骨髓干細胞系分子標記物。我們推測從心臟分離出來的干細胞，亦不能夠排除來源于血液和骨髓細胞遷移的可能。這些細胞剛剛定居于心臟內(nèi)，處于未分化狀態(tài)，尚未失去骨髓源干細胞標記物，而且骨髓干細胞也表達c-kit。因此，我們用流式細胞儀鑒定了c-kit+CD34-CSCs的細胞比例。

我們用免疫磁珠分選未經(jīng)完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞進行流式細胞鑒定，有70.23%的心臟細胞為c-kit陽性CD34陰性，這意味著該方法所得到的細胞中，有70.23%的細胞屬于心臟干細胞。這一結(jié)果充分說明，改良后的此方法可獲得較純的心臟干細。對其余不足30%的細胞來說，存在有以下可能：①暫時未表達c-kit，因為心臟干細胞中c-kit的表達存在著時限性。Messina等人研究表明，心臟干細胞表面c-kit的表達由培養(yǎng)第1天的10%至培養(yǎng)第6天上升至30%以上[4]。因此，我們推測，鑒于本實驗將所得的心臟細胞在免疫磁珠分選后即刻便行流式細胞儀鑒定其c-kit表達，有可能部分心臟干細胞細胞表面尚未表達c-kit。②未用mNSCM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。mNSCM培養(yǎng)基中含有LIF和bFGF，適宜濃度的LIF和bFGF可在心臟干細胞增殖過程中維持心臟干細胞的多分化潛能狀態(tài)。同時，由于酶消化法分離培養(yǎng)的內(nèi)源性心臟干細胞中常帶有成纖維細胞等雜細胞，在培養(yǎng)過程中，心臟干細胞為懸浮細胞，利用差速貼壁分離法，可以去除這些易于貼壁的雜細胞，進一步提高了c-kit+CSCs的純度。③c-kit陰性的心臟干細胞。不是所有心臟干細胞都表達c-kit，c-kit也并不是心臟干細胞的唯一鑒定標記。只是隨著心臟干細胞細胞的成熟，許多干細胞表面標記逐漸消失，c-kit是唯一的不隨心臟干細胞細胞成熟而消失的表面標記[3]。采用其他的心臟干細胞表面標記如Sca-1等予以鑒定也許可以得到不同成熟程度的心臟干細胞。

鑒于冠心病的發(fā)病人群是40歲以上中老年人群，因此，本課題從成年鼠心臟中分離心臟干細胞將在一定程度上縮短實驗研究結(jié)果與臨床應用的距離。盡管Beltrami及其同事在10年前發(fā)現(xiàn)了心臟干細胞的存在，目前仍需開展大量實驗研究進一步探索CSCs的生物學特性，并在此基礎上進行相應的臨床研究，盡早地將心臟干細胞治療心血管疾病這一治療策略,安全有效地應用于臨床治療，早日攻破人類心臟再生修復這一難題。

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Isolationandidentificationofcardiacstemcellsfromadultmice

Dengwenwen,Zhaoranzun,Longxianping,Shibei

(Department of Cardiology, The Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Guizhou Zunyi 563099, China)

ObjectiveTo establish a stable method for the isolation of cardiac stem cells (CSCs) and identify the biological characteristics of CSCs.MethodsHearts from adult CD1 mice were cut into pieces and digested with collagenase II and trypsin repeatedly. Differential centrifugation was employed to remove ventricular cardiomyocytes. CSCs purity was achieved by using magnetic activated cell sorting (MACS) to purify c-kitposCSCs and the outcome of the c-kitposCSCs was verified with flow cytometry (FCM).ResultsC-kitposCSCs were successfully separated and purified from adult CD1 mouse hearts using enzymatic digestion combined with MACS. Using FCM, we demonstrated that after MACS, the proportion of c-kitposCD34negCSCs increased from 4.62% to 70.23%.ConclusionCSCs in adult mouse can be isolated and culturedinvitroby collagenase II and trypsin digestion and MACS, which is more efficient to isolate c-kitposcardiac stem cells compared with the tissue expansion method, and more useful to investigate CSC-related signaling pathwaysinvitro. The c-kitposCSCs proliferate more stably and fasterinvitrothan the other cell types，which may lead to significant in vitro experiments to elucidate the related signal pathways.

cardiac stem cells; cell isolation; enzymatic digest; magnetic activated cell sorting

石蓓，女，教授，碩士生導師，研究方向：冠心病干細胞移植治療，E-mail:shibei2147@163.com 。

R541

A

1000-2715(2013)05-0406-04

[收稿2013-07-12;修回2013-09-13]

(編輯：譚秀榮)