錢昱霏，劉建國，白國輝,2，管曉燕，韓 琪，白朋元

(1.遵義醫(yī)學院 口腔學院，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學院 醫(yī)學與生物學研究中心，貴州 遵義 563099)

轉基因番茄中外源目的蛋白提取液的篩選

錢昱霏1，劉建國1，白國輝1,2，管曉燕1，韓 琪1，白朋元1

(1.遵義醫(yī)學院 口腔學院，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學院 醫(yī)學與生物學研究中心，貴州 遵義 563099)

目的比較兩種不同配方的蛋白提取液提取轉基因番茄蛋白的效果。方法用A、B兩種植物蛋白提取液提取相同防齲用轉基因番茄蛋白，運用western blot、BCA法和間接ELISA法對提取出的轉基因番茄外源目的蛋白進行檢測。結果兩種提取液提取的蛋白樣品均在相對分子質量約為60 KDa處出現了低分子量蛋白條帶，但植物蛋白提取液B所提取蛋白樣品條帶更清晰。蛋白提取液A、B分別提取的相同轉基因番茄總蛋白為8.375 mg/mL和12.838 mg/mL,而其外源目的蛋白的含量分別是0.335 μg/mL和1.16 μg/mL，比值為2.25倍。經重復實驗驗證B液提取的目的蛋白在總蛋白含量的百分比較A液所提取的高，具有統計學意義(P<0.05)。結論植物蛋白提取液B提取轉基因番茄中外源目的蛋白較提取液A更為高效并且省時。

轉基因番茄；植物蛋白提取液；變異鏈球菌；外源目的蛋白

植物轉基因技術是通過研究植物自身性狀并改變其基因來調控植物的生長和發(fā)育的手段之一。目前國內外研究中發(fā)現轉基因植物中外源目的蛋白的含量很低，如何提取并獲得高效、高濃度的轉基因植物外源目的蛋白已成為轉基因檢測技術的重點之一。本課題組前期運用番茄作為生物反應器，對表達了變異鏈球菌毒力因子表面蛋白 PAc與霍亂毒素B亞單位(CTB)嵌合基因的轉基因番茄防齲疫苗進行了遺傳穩(wěn)定性、生態(tài)安全性和免疫動物安全性等系列研究[1-5]。本實驗用兩種不同配方的轉基因植物蛋白提取液提取轉基因番茄中的外源蛋白，比較兩種提取液的提取效果。

1 材料與方法

1.1 材料和主要試劑 含外源重組基因pacA-ctxB的轉基因番茄果實(本課題組前期培育)；表面蛋白抗原PAc，抗PAc抗體(本課題組前期提取)；增強型BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術研究所)；800CW標記山羊抗兔二抗(基因有限公司)；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(碧云天生物技術研究所)。

1.2 方法

1.2.1 植物蛋白提取液配制[6-7]分別按以下配方配制植物蛋白提取液A、B， 4℃保存(見表1)。

表1植物蛋白提取液配方

A試劑劑量B試劑劑量1Mtirs-HCL(pH8)150mLNa2HPO43.581g甘油250mLKH2PO40.408gPVP4020.0gNaCl5.844g雙蒸水定容至1000mL抗壞血酸鈉4.953gPVP405.0g纖維二糖0.343g甲基吡喃糖苷0.194g植物蛋白酶抑制劑5.0g雙蒸水定容至1000mL

1.2.2 實驗總流程 用本課題組前期培育的20株轉基因番茄果實每株都用A、B兩種提取液提取總蛋白后，Western blot 進行將篩選出含目的蛋白的5株轉基因番茄做總蛋白和目的蛋白濃度的進一步研究，比較這5株樣品分別用A、B液提取總蛋白，BCA法確定樣品中總蛋白量，ELISA法確定樣品中外源蛋白量，最后計算出目的蛋白濃度占可溶性總蛋白濃度的比例。該實驗過程重復5次。

1.2.3 轉基因番茄總蛋白的提取 將每株轉基因番茄果肉取2 g，平均分為兩份放入提前置于冰上的兩個不同研缽中，每缽體中有果肉組織1 g。將每個研缽的果肉剪成小塊，加入液氮研磨成粉，其中1個研缽中加入預冷的植物蛋白提取液A 3.5 mL勻漿后，靜置4 h(操作均在冰上完成)使其充分裂解。4 ℃，14 000 rpm×15 min離心，取上清1 mL/只分裝并標記，-20 ℃保存。另1個研缽加入同樣預冷的植物蛋白提取液B 3.5 mL，用研杵順時針用力適中充分勻漿，直接于4 ℃，14 000 rpm×15 min離心，上清過濾后，1 mL/只分裝并標記，-20 ℃保存。共40份樣品。

1.2.4 Western blot篩選目的蛋白表達的番茄植株 將轉基因番茄蛋白溶液與蛋白上樣緩沖液按比例混合后在沸水中水浴加熱5 min，制成變性蛋白質樣品，經SDS-PAGE電泳后轉印(45 V，4 h)在PVDF膜上。抗PAc抗體為一抗，800 cw標記山羊抗兔二抗對目的蛋白進行Western blot分析。

1.2.5 總蛋白的含量測定 將含目的蛋白的轉基因番茄蛋白樣品用BAC法按產品說明進行檢測及初步的定量。取5株含目的蛋白的轉基因番茄蛋白樣品根據BCA標準品稀釋濃度梯度后測波長為562 nm時的線性方程，通過OD值計算出總蛋白濃度。

1.2.6 ELISA法測定目的蛋白的濃度 分別取PAc標準蛋白濃度梯度液、轉基因番茄蛋白提取液和抗原包被液包被酶標板，每孔100 μL，各3孔，4 ℃孵育過夜。次日棄液每孔加入150 μL抗原包被液，室溫放3 min后再各孔加入100 μL封閉液37 ℃濕盒濕育2 h。洗板，每孔加入100 μL抗PAc抗體(一抗，1:80)37 ℃濕盒濕育2 h。洗板，每孔加入100 μL HRP標記的山羊抗兔IgG-HRP(二抗，1:1000)37 ℃濕盒濕育1 h。洗板，每孔加入100 μL第五反應液，37 ℃暗反應15 min后每孔加入50 μL終止液終止反應。于酶標儀上記錄波長490 nm處的線性方程，并通過樣本OD值算出外源目的蛋白濃度。

1.2.7 數據處理 將含有外源目的蛋白PAcA-CTB的同植株用兩種提取液分別提取的蛋白進行重復實驗后，實驗數據用SPSS17.0統計軟件，采用獨立樣本t檢驗進行統計分析。

2 結果

2.1 轉基因番茄目的蛋白的表達 將兩種不同植物蛋白提取液所提取的相同轉基因番茄果實蛋白樣品進行Western blot檢測，篩選出含有相對分子質量約為60kDa蛋白(即PAcA-CTB蛋白)的樣品，共12株(見圖1)。

注：A：1-7：植物蛋白提取液A所提轉基因番茄樣本；B：1-7：植物蛋白提取液B所提轉基因番茄樣本。 圖1 Western blot篩選表達了外源目的蛋白的轉基因番茄植株

2.2 轉基因番茄總蛋白的含量 根據BCA法檢測的線性方程：Y=1.0822X+0.1249，相關系數R=0.9987，可見OD值隨蛋白濃度增加而增大(見圖2)。測得用A液提取的含PAcA-CTB蛋白的轉基因番茄樣本稀釋60倍后的濃度為0.1 346 mg/mL，用B液提取的含PAcA-CTB蛋白的轉基因番茄樣本稀釋70倍后的濃度為0.1 834 mg/mL，因此計算得出A液提取的含PAcA-CTB蛋白的轉基因番茄樣本總蛋白濃度為8.375mg/mL，B液提取的含PAcA-CTB蛋白的轉基因番茄樣本總蛋白濃度為12.838 mg/mL。

2.3 轉基因番茄外源目的蛋白的表達量 用間接ELISA法檢測的線性方程：Y=1.278X+0.1376，相關系數R=0.9839，顯示OD值隨蛋白濃度增加而增大(見圖3)。其用A液提取的含PAcA-CTB蛋白的轉基因番茄樣本稀釋5倍后的濃度為0.067 μg/mL，用B液提取的含PAcA-CTB蛋白的轉基因番茄樣本稀釋5倍后的濃度為0.232 μg/mL，因此計算得出A液提取的含PAcA-CTB蛋白的轉基因番茄樣本總蛋白濃度為0.335 μg/mL，B液提取的含PAcA-CTB蛋白的轉基因番茄樣本總蛋白濃度為1.16 μg/mL。

根據2.2所得的轉基因番茄總蛋白濃度可算出，用A液提取的含PAcA-CTB蛋白的轉基因番茄外源目的蛋白所占的比例為0.004%，用B液提取的含PAcA-CTB蛋白的轉基因番茄外源目的蛋白所占的比例為0.009%，后者為前者的2.25倍。

圖2 轉基因番茄的總蛋白曲線

圖3 轉基因番茄的目的蛋白曲線

2.4 數據處理 進行5次重復實驗后，將兩種提取液分別提取的每株轉基因番茄的總蛋白濃度和目的蛋白在總蛋白含量的百分比分別進行組間比較，又均值可看出，B液提取的總蛋白濃度和百分比含量的均值都比A液大，且運用獨立樣本t檢驗進行兩兩比較，結果均有統計學意義(P<0.05，見表2，3)。

分組實驗次數12345A8.119±0.0107.841±0.1128.375±0.2757.949±0.0968.350±0.298B12.859±0.00212.811±0.00112.838±0.02712.787±0.00312.803±0.004

注：A：用蛋白提取液A提取的蛋白組；B：用蛋白提取液A提取的蛋白組；P<0.05。

分組實驗次數12345C0.00403±0.000110.00422±0.000090.00400±0.000100.00403±0.000100.00409±0.00006D0.00913±0.000020.00910±0.000040.00906±0.000040.00942±0.000060.00955±0.00114

注：C：用蛋白提取液A提取的蛋白組；D：用蛋白提取液A提取的蛋白組，P<0.05。

3討論

3.1 兩種植物蛋白提取液提取結果的比較 實驗中運用兩種不同蛋白提取液提取20株轉基因番茄5次，并進行檢測。western blot篩選出12株含目的蛋白的轉基因番茄，均在相對分子質量約為60KDa處出現了低分子量蛋白條帶，說明兩種植物蛋白提取液均能提取出含PAcA-CTB蛋白的轉基因番茄蛋白樣品。B液所提取出的蛋白樣品本身就相對A液所提取出的較濃稠，蛋白條帶顏色較深、縱條紋干擾少并且更為清晰。再將5次測得的總蛋白濃度和目的蛋白占總蛋白濃度的百分比分別進行統計求出均值，發(fā)現兩種提取液提取的同株番茄的總蛋白含量和目的蛋白占總蛋白含量的百分比的均值中都顯示了后者大于前者(見表2，3)，再將5次的實驗結果進行兩組之間的比較發(fā)現P<0.05，具有統計學意義。根據總蛋白濃度檢測和ELISA間接法對外源目的蛋白檢測得出含PAcA-CTB蛋白的轉基因番茄外源目的蛋白所占的比例顯示，B液所提取的含PAcA-CTB蛋白的轉基因番茄外源目的蛋白比例是A液所提取的2.25倍。前期課題組就發(fā)現B液所提取的含PAcA-CTB蛋白的轉基因番茄外源目的蛋白比例比A液所提取的蛋白樣品外源目的蛋白高[6-7]，由于本實驗的轉基因植物是本課題組前期種植結果后放置于-20℃保存一段時間，未能用新鮮的植株果實進行實驗，故其蛋白可能因時間原因發(fā)生降解，得到的值可能相應降低。但本課題組前期的實驗結果與該實驗結果趨勢是吻合的。

3.2 兩種植物蛋白提取液的比較 提取植物蛋白的過程中應避免蛋白質的損失和降解，運用植物蛋白提取液充分溶解植物蛋白質是進行后續(xù)蛋白檢測的先決條件。本實驗中，就植物蛋白提取液所提取蛋白的過程里，將植物放入研缽加入液氮研磨成粉后加入提取液A則需要靜置4h才能離心取上清，而加入提取液B只需充分勻漿后可即刻離心取上清，大大縮短了實驗時間。

Tris-HCL緩沖液作用較多，被廣泛用作核酸和蛋白質的溶劑，同時也是蛋白質電泳緩沖液的主要成分之一。此外，還可作為表面活性劑、硫化促進劑和一些藥物。Tris也被用作滴定標準物。甘油主要用作保濕劑、保潤劑、吸濕劑、潤滑劑、柔軟劑、軟化劑、增稠劑、增塑劑、稀釋劑、防凍劑等。聚乙烯吡咯烷酮(簡稱聚維酮；PVP)的用途廣泛，是良好的澄清劑、吸附劑、著色穩(wěn)定劑和肢體穩(wěn)定劑。PVP40是PVP K40的簡稱，是聚乙烯吡咯烷酮(簡稱聚維酮)系列中分子量(K值)在40左右的高分子聚合物，與PVP K30的性質基本相同。只是K值增大了，聚合物的分子量也增大，溶液粘度相應提高。在蛋白質提取過程中,經常受植物組織中色素、酚類、醌類等次生代謝物質的干擾,我們通過在液氮中加入少量PVP，吸附組織中的色素和酚類物質,同時也可保證樣品在液氮中的充分研磨[8]，從而盡可能的去除上述的雜質。且大分子量的PVP能夠提高蛋白的穩(wěn)定性[9]。Na2HPO4、KH2PO4在化學分析中起緩沖劑的作用，NaCl則作為防腐劑?？箟难犭x子是維生素C的藥效基團，維生素C具有抗氧化作用，因此抗壞血酸鈉在配方中則是作為抗氧化劑存在，能中和氧氣和氧自由基[10]。植物的主要成分是纖維素，纖維素的基本結構則是纖維二糖。纖維二糖是由兩個葡萄糖通過β-1，4-糖苷鍵連接而形成的二糖, 纖維二糖是纖維素水解的產物,也是纖維素的基本結構單元[11]。Shafeeq 等[12]指出運用纖維二糖在假設植物的碳水化合物的自然環(huán)境下對肺炎鏈球菌的轉錄層面進行調控，研究出纖維二糖對其操縱子有穩(wěn)定作用。甲基吡喃糖苷是競爭性洗脫物。從兩種配方的試劑可以看出提取轉基因防齲用番茄中外源目的蛋白效果好的提取液B不僅運用了穩(wěn)定劑、緩沖劑、防腐劑、還原劑和植物蛋白酶抑制劑，最重要的是根據植物自身的特點運用纖維二糖生成纖維素作為植物的“細菌”,利用自身分泌的纖維素酶來分解植物遺體。當親和純化一些糖蛋白時，用甲基吡喃糖苷可以把親和在填料上的糖蛋白給競爭掉，從而洗脫下所要的目的糖蛋白 。從上述配方成分可看出B液配方較A液提取的蛋白樣品更加的穩(wěn)定。運用B液提取的轉基因植物的蛋白樣品外源目的蛋白丟失相對降低，且實驗操作較為省時，并能從轉基因植物中提取出高濃度的外源目的蛋白，為下一步的轉基因植物檢測應用奠定了基礎。總之，植物蛋白提取液B提取的轉基因番茄外源目的蛋白較提取液A更為高效并且省時。

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[收稿2013-01-14;修回2013-03-17]

(編輯：譚秀榮)

Screeningofextractionoftransgenictomatoexpressingtargetprotein

Qianyufei1,Liujianguo1,Baiguohui1,2,Guanxiaoyan1,Hanqi1,Baipengyuan1

(1.Stomatological School, Zunyi Medical University, Guizhou Zunyi 563099, China; 2.The center for medicine and biology, Zunyi Medical University, Guizhou Zunyi 563099, China)

ObjectiveTo compare two kinds of extraction method of transgenic tomato expressing target protein by optimizing the reagent formula.MethodsTwo kinds of plant protein extracting solution A and B were applied to extract genetically modified tomato protein for caries prevention. Western blot analysis, BCA assay and indirect ELISA method were performed to test exogenous protein level of transgenic tomato.ResultsThe protein samples extracted from two extracting solution were all appeared The low density protein bands with relative molecular weight of 60 KD were shown in the protein samples extracted from two extracting solution. The extracted protein sample bands of plant protein extracting solution B were thicker and more distinct than those in solution A. The total protein contents of transgenic tomato extracted from solution A and B were 8.375 mg/mL and 12.838 mg/mL, while exogenous target protein levels were 0.335 μg/mL and 1.16 μg/mL, respectively, with the ratio of 2.25 times. The percentage of purpose protein in total protein extracted from solution B through repeated experiments was more than that from solution A (P<0.05).ConclusionThe extraction method using plant protein extracting solution B is an efficient and timesaving mthod of transgenic tomato expressing target protein extraction.

Transgenic tomato; plant protein extracting solution; streptococcus mutans; exogenous purpose protein

S641.2

A

1000-2715(2013)02-0116-05

國家自然科學基金項目(NO：30160086，81260164)；貴州省優(yōu)秀科技人才省長專項基金項目(NO：黔省專合字[2006]44)；貴州省科技攻關項目(NO:黔科合SY字[2012]3086)；貴州省科技廳聯合基金項目(NO:黔科合J字LKZ[2011]41)。

劉建國，男，教授，碩士生導師，研究方向：齲病和氟斑牙相關研究，E-mail:13087891001@163.com。