惠學(xué)玲，馮國紋，余麗梅，王鈺瑩，楊 進，趙春華

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 貴州省細胞工程重點實驗室， 貴州 遵義 563099；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院組織工程中心， 北京 100005)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究·

rhEGF凝膠對兔皮膚Ⅲ度燒傷創(chuàng)面TNF-α水平的影響

惠學(xué)玲1，馮國紋1，余麗梅1，王鈺瑩1，楊 進1，趙春華2

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 貴州省細胞工程重點實驗室， 貴州 遵義 563099；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院組織工程中心， 北京 100005)

目的觀察重組人表皮生長因子(rhEGF)凝膠治療兔皮膚Ⅲ度燒傷的作用及創(chuàng)面組織腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平的變化。方法銅棒燙傷致兔腹背部皮膚Ⅲ度燒傷，切痂后治療側(cè)用rhEGF凝膠涂抹創(chuàng)面，自身對照側(cè)涂等體積生理鹽水，肉眼觀察兩側(cè)創(chuàng)面修復(fù)情況，并測量未愈合創(chuàng)面面積，HE染色后進行病理組織學(xué)檢查，ELISA法檢測組織TNF-α水平。結(jié)果治療第3、18天，rhEGF治療側(cè)創(chuàng)面愈合率顯著高于對照側(cè)(P<0.05)；治療第3天，rhEGF治療側(cè)創(chuàng)面組織紅腫明顯較對照側(cè)輕。病理學(xué)檢查顯示，rhEGF側(cè)組織紅腫明顯較對照側(cè)輕，炎細胞浸潤也較少，且創(chuàng)面組織中TNF-α含量明顯低于對照側(cè)(P<0.01)。結(jié)論rhEGF凝膠可明顯促進兔皮膚Ⅲ度燒傷修復(fù)，與其在炎癥期降低創(chuàng)面組織TNF-α水平，減輕炎癥反應(yīng)有關(guān)。

重組人表皮生長因子凝膠；Ⅲ度燒傷；腫瘤壞死因子-α

皮膚移植是較大面積Ⅲ度燒傷最重要的治療手段，目前常用的皮片包括自體皮膚、豬皮、人工皮膚等；此外，重組人表皮生長因子(recombinant human epidermal growth factor，rhEGF)與人羊膜等生物材料也開始用于臨床[1-3]。研究表明，燒傷炎癥期，IL-1β、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、IL-10、INF-γ等多種炎癥與抗炎因子，參與炎癥反應(yīng)的過程；表皮生長因子、VEGF等因子則促進細胞增殖，在修復(fù)期參與新生組織的形成與創(chuàng)面愈合[4-5]。rhEGF是采用基因工程技術(shù)生產(chǎn)的一種可以促進表皮細胞增殖、分化的多肽類生長因子，可明顯促進難愈合創(chuàng)面和深Ⅱ度燒傷的創(chuàng)面愈合[6]。臨床上rhEGF凝膠涂抹于難愈性創(chuàng)面和Ⅱ度燒傷均取得了較好的治療效果[7-8]。本實驗將rhEGF凝膠用于兔皮膚Ⅲ度燒傷，主要觀察其對炎癥期創(chuàng)面炎癥反應(yīng)及創(chuàng)面組織TNF-α水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康新西蘭大白兔由重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司提供，許可證號SCXK(渝)2012-0006，體重2.0～2.5 kg，雌雄各半。清潔級動物室適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，術(shù)前24 h禁食不禁水。

1.2 主要試劑與儀器 硫化鈉(由上?；瘜W(xué)試劑總廠生產(chǎn)，批號20090306)，戊巴比妥鈉(由北京化學(xué)試劑公司生產(chǎn)，批號060222)，rhEGF凝膠(由桂林華諾威基因藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號S20020112)，密閉，4～25 ℃保存， BCA蛋白濃度測定試劑盒購于江蘇碧云天生物技術(shù)研究所(批號P0010S-1)，TNF-αELISA檢測試劑盒購于上海雅吉生物科技有限公司(批號201210)，自制銅棒直徑4 cm。

1.3 Ⅲ度燒傷模型制備 15只兔備皮后，用6%硫化鈉局部涂抹脫毛，3%戊巴比妥鈉1.0 mL/kg耳緣靜脈注射麻醉，用銅棒直接貼于兔腹背部兩側(cè)對稱的皮膚，180 ℃燙8 s，皮膚呈蠟白色，病理證實燙傷深達皮下組織，確認為Ⅲ度燒傷創(chuàng)面。

1.4 實驗分組與處理 兔燒傷48 h后切痂，用透明方格紙測量切痂后的創(chuàng)面面積，采用photoshop軟件計算燙傷面積。兔左側(cè)創(chuàng)面涂抹約2.5 g rhEGF凝膠一層，為rhEGF側(cè)，右側(cè)為對照側(cè)，涂抹等體積生理鹽水，兩側(cè)各敷一層油紗后加壓包扎。

1.5 創(chuàng)面愈合率 治療后第3、18天，分別測量其未愈合的創(chuàng)面面積，計算創(chuàng)面愈合率。愈合率=(原始創(chuàng)面面積-未愈合創(chuàng)面面積)/原始創(chuàng)面面積×100%。

1.6 組織病理學(xué)檢查 肉眼觀察創(chuàng)面紅腫、炎癥反應(yīng)狀態(tài)及愈合的一般情況，治療后第3、18天各處死5只動物，取創(chuàng)面新生組織，固定、石蠟包埋、切片、HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理學(xué)變化。

1.7 ELISA法檢測TNF-α 治療后第3天處死動物后立即從創(chuàng)面中央取新生組織0.1g，分別將組織剪碎，置于勻漿器中，加入預(yù)冷的PBS 1 mL，冰浴上研磨10 min，12 000 r/min，4 ℃，離心10 min，取上清液，用BCA蛋白濃度測定試劑盒進行總蛋白濃度測定，將上清液中的總蛋白濃度定量在1 mg/mL,然后按兔TNF-αELISA試劑盒操作說明，450 nm條件下，測定吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過線性方程計算均漿液中TNF-α含量(pg/mL)。

2 結(jié)果

2.1 創(chuàng)面愈合率 治療第3、18天，rhEGF側(cè)愈合率均明顯高于對照側(cè)(P<0.05)(見表1)。

組別 第3天第18天 rhEGF側(cè)23.72±3.97*93.33±2.08* 對照側(cè)17.62±3.7189.64±1.61

注：*P<0.05與對照側(cè)比較。

2.2 組織病理學(xué)檢查 燙傷后48 h，創(chuàng)面形成，切取焦痂下創(chuàng)面組織，HE染色，顯微鏡下觀察，未見皮膚全層結(jié)構(gòu)，僅見組織凝固性壞死(圖2A)，確認Ⅲ度燒傷模型建立成功；rhEGF凝膠治療第3天，肉眼可見，對照側(cè)創(chuàng)面存在較為明顯的紅腫，而rhEGF側(cè)創(chuàng)面紅腫明顯減輕(見圖1A、B)。高倍鏡下觀察，雙側(cè)創(chuàng)面組織均未見皮膚的組織結(jié)構(gòu)，對照側(cè)可見皮下組織水腫明顯，并有較多炎性細胞浸潤(見圖2B)，而rhEGF側(cè)皮下組織水腫明顯減輕，炎性細胞也較少(見圖2C)。第18天，雙側(cè)創(chuàng)面明顯縮小，以rhEGF側(cè)更為明顯，均未見明顯紅腫(見圖1C、D)，鏡下觀察已可見較完整的皮膚組織結(jié)構(gòu)及新生的肉芽組織。

2.3 創(chuàng)面組織TNF-α水平 燒傷創(chuàng)面自然過程中，1周內(nèi)主要為炎癥期，之后才進入修復(fù)期。為此治療后第3天，檢查結(jié)果顯示rhEG側(cè)創(chuàng)面組織中TNF-α水平明顯低于對照側(cè)(P<0.01)(見表2)。

組 別第3天rhEG側(cè)1597.06±35.70**對照側(cè)1781.76±89.24

注：**P<0.01與對照側(cè)比較。

注：A、B為第3天，C、D為第18天，A、C為rhEGF凝膠側(cè)，B、D為對照側(cè)。 圖1 rhEGF凝膠對兔Ⅲ燒傷創(chuàng)面愈合的影響

注：A為模型，B為對照側(cè)，C為rhEGF側(cè)。 圖2 rhEGF凝膠治療第3天創(chuàng)面組織病理學(xué)檢查(HE A: ×40，B、C：×400)

3 討論

表皮生長因子是廣泛存在于生物體內(nèi)的活性蛋白質(zhì)，表皮生長因子及其受體存在于除造血系統(tǒng)以外的所有組織中，它的生理功能非常廣泛，可影響表皮細胞或成纖維細胞等的細胞周期轉(zhuǎn)換，加速細胞的分裂增殖，促進組織修復(fù)細胞內(nèi)DNA與RNA以及蛋白質(zhì)的合成，表皮生長因子為創(chuàng)面肉芽組織形成及參與創(chuàng)面修復(fù)所需要的一種細胞因子[9-10]。rhEGF在分子結(jié)構(gòu)、生物學(xué)活性及生理功能上與人內(nèi)源性表皮生長因子高度一致[11]。研究表明rhEGF對深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面有促進愈合，減少瘢痕增生的作用。作為外源性生長因子，rhEGF凝膠能促進皮膚創(chuàng)面組織修復(fù)過程的DNA、RNA 和羥脯氨酸的合成，進而加快創(chuàng)面肉芽組織的行成以及上皮細胞的增殖，從而使創(chuàng)面愈合時間縮短，其機制與rhEGF凝膠使創(chuàng)面局部形成一個濕潤的、適宜組織修復(fù)的環(huán)境，促進壞死組織脫落和肉芽組織生長有關(guān)[7]。

本實驗將rhEGF凝膠用于Ⅲ度燒傷模型，治療第3天，rhEGF側(cè)愈合率高于對照側(cè)，肉眼也觀察到對照側(cè)創(chuàng)面明顯紅腫，而rhEGF側(cè)創(chuàng)面的紅腫明顯減輕，且高倍鏡下可見對照側(cè)皮下組織水腫明顯，并有較多炎性細胞浸潤，而rhEGF側(cè)皮下組織水腫明顯減輕，炎性細胞也相對較少，表明rhEGF凝膠具有明顯的創(chuàng)面保護作用，在炎癥期即可減輕炎癥反應(yīng)，也可一定程度地促進創(chuàng)面修復(fù)。治療第18天，rhEGF側(cè)的愈合率以接近95%的愈合標(biāo)準(zhǔn)，顯著高于的對照側(cè)，表明rhEGF凝膠在Ⅲ度燒傷創(chuàng)面修復(fù)期中發(fā)揮了重要作用，從而明顯促進創(chuàng)面修復(fù)，縮短愈合時間，療效明顯優(yōu)于單獨的創(chuàng)面油紗覆蓋、包扎。TNF-α是由炎細胞產(chǎn)生的重要炎癥因子，可同其它炎癥因子一起介導(dǎo)燒傷創(chuàng)面的炎癥反應(yīng)，損傷組織[12-13]。檢測創(chuàng)面組織中TNF-α含量，也發(fā)現(xiàn)rhEGF側(cè)TNF-α水平明顯低于對照側(cè)，表明rhEGF凝膠所發(fā)揮的抗炎作用，與降低局部組織TNF-α水平有關(guān)，也可能與rhEGF凝膠的創(chuàng)面濕潤、創(chuàng)面保護，間接減輕炎癥反應(yīng)和降低炎癥因子水平?？傊瑀hEGF凝膠可促進兔皮膚Ⅲ度燒傷的愈合，其作用機制與炎癥期降低創(chuàng)面TNF-α水平，從而減輕炎癥損傷有關(guān)。

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[收稿2012-10-14;修回2013-02-17]

(編輯：譚秀榮)

EffectsoftherecombinanthumanepidermalgrowthfactorgelonTNF-αlevelofrabbitswithskinthirddegreeburn

Huixueling1，F(xiàn)engguowen1，Yulimei1，Wangyuying1，Yangjin1，Zhaochunhua2

(1.Key Laboratory of Cell Engineering of Guizhou Province, the Affiliated Hospital of Zunyi Medical Universty,Guizhou Zunyi 563099,China; 2.Tissue Engineering Center, Chinese Academy of Medical Science,Beijing 100005,China)

ObjectiveTo observe the effects of the recombinant human epidermal growth factor (rhEGF) gel on skin third degree burn in rabbits and the level of tumor necrosis factor-α(TNF-α)in the wound tissue.MethodsThe skin third degree burn of front and rear part in the New Zealand rabbits was made by ambustion of copper bar. The rhEGF gel was smeared on the wound of the treatment side after surgical removal of the scar and equal-volume of physiological saline was smeared on the control side. The process of wound restoration was observed and unhealthy wound area was measured. HE Staining of wound tissue was performed for histological examination. TNF-α level was detected using enzyme-1inked immunosorbent assay.ResultsThe wound healing rate of rhEGF treatment side was notably higher than that in the control side in the third and 18th days after treatment (P<0.05). In the third day after treatment,red swelling in the rhEGF treatment side was markedly slighter than that is the that in the control side.histological examination showed that the milder edema, less inflammatory cells and lower content of TNF-α in rhEGF treatment side were detected than those in the control side.ConclusionrhEGF gel could promote the repair of skin third degree burn in rabbits and this effect might be associated with the decreased TNF-α level of wound tissue and the reduced inflammatory reaction in inflammation phase.

the recombinant human epidermal growth factor gel; third degree burn; tumor necrosis factor-α

R644

A

1000-2715(2013)02-0101-04

貴州省科技廳平臺建設(shè)資助項目(NO:209.001.106.01)。

趙春華，男，博士，教授，研究方向：干細胞基礎(chǔ)與臨床，E-mail:chunhuaz@public.tpt.tj.cn。