秦迎春，劉 鵬，楊立榮，徐 剛，吳堅(jiān)平

(浙江大學(xué) 化學(xué)工程與生物工程學(xué)系，杭州 310027)

光學(xué)純的S－2－氯丙酸(S－2－CPA)在芳氧丙酸類(lèi)除草劑合成中具有重要用途。該類(lèi)除草劑中都有1個(gè)手性碳原子，具有2種光學(xué)異構(gòu)體。其中由S－2－CPA合成的D－(－)異構(gòu)體為高效體，藥效比L－(+)異構(gòu)體高6～12倍［1］。鑒于S－2－CPA重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值，開(kāi)發(fā)高效低成本酶法制備高光學(xué)純度S－2－CPA的方法就很有意義。R－2－CPA脫鹵酶可以選擇性脫除R－2－CPA中的Cl，當(dāng)將其用于消旋2－CPA的動(dòng)力學(xué)拆分時(shí)，在反應(yīng)體系中剩余未反應(yīng)的底物即為S－2－CPA。目前，R－2－CPA脫鹵酶的品種少，活性穩(wěn)定性等性質(zhì)也不盡如人意，因此仍需要尋找新的R－2－CPA脫鹵酶，或者改造原有的R－2－CPA脫鹵酶，以適應(yīng)工業(yè)需要。

筆者所在實(shí)驗(yàn)室在農(nóng)藥廠(chǎng)附近的含氯污泥中分離到了1株有R－2－CPA脫鹵酶活性的菌株［2］，林春嬌等［3］從該菌株中克隆了 R －2 － CPA脫鹵酶DehDIV－R的基因。目前，DehDIV－R野生型基因通過(guò)載體pET30a(+)在大腸桿菌BL21構(gòu)建的工程菌，經(jīng)誘導(dǎo)條件優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)酶的比酶活可達(dá)10.43 U/mg，催化能力較強(qiáng)，有很好的工業(yè)應(yīng)用潛力。但是仍有希望通過(guò)酶的分子改造獲得酶活更高、熱穩(wěn)定性更強(qiáng)的突變體，以適應(yīng)工業(yè)應(yīng)用要求。

筆者采用定向進(jìn)化［4－7］的手段建立高通量篩選突變文庫(kù)，再經(jīng)過(guò)高通量篩選得到酶活提高的突變子，以期研究突變子中突變位點(diǎn)的改變前后對(duì)酶催化活力影響的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌BL21(DE3)，DehDIV－R菌株由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保藏，電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)［8］由筆者所在實(shí)驗(yàn)室自行制備。表達(dá)質(zhì)粒pET30a(+)購(gòu)于美國(guó)Novagen(WI)公司。

1.1.2 工具酶與試劑

限制性?xún)?nèi)切酶Eco RI和Hind III以及T4 DNA連接酶、Pfu DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、PCR反應(yīng)所需試劑均購(gòu)買(mǎi)于TaKaRa公司?？敲顾刭?gòu)自Sigma公司，PCR引物由上海生物工程有限公司合成，DNA試劑回收盒購(gòu)自上海生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 高通量篩選方案

根據(jù)文獻(xiàn)［9］的Cl檢測(cè)方法，建立了一種基于Cl+濃度的顯色反應(yīng)的高通量篩選方法，用于快速、有效地檢測(cè)水解R－2－氯丙酸的速率，從而能夠?qū)γ擕u酶的活性進(jìn)行初步篩選。對(duì)于構(gòu)建好的DehII－S突變文庫(kù)，采用96孔板進(jìn)行表達(dá)。操作流程:將40 μL的發(fā)酵上清移至96酶標(biāo)板中，逐步添加60 μL 的飽和 Hg(SCN)2乙醇溶液，150 μL 60 g/L的FeNH4(SO4)2·12H2O(含1%硝酸)水溶液和50 μL試樣，室溫下放置10 min后，在酶標(biāo)儀中檢測(cè)450 nm下的吸光值OD450。

1.2.2 蛋白純化

先將破胞獲得的上清粗酶液用0.22 μm的濾膜過(guò)濾，準(zhǔn)備上樣。使用上樣緩沖液A(binding buffer)沖以流速1.0 ml/min平衡 Ni2+親和層析柱。將過(guò)濾后的粗酶液上樣，用緩沖液A洗10個(gè)柱體積，再用洗脫緩沖液B(20 mmol/L Na3PO4緩沖液(pH 7.4)，500 mmol/L NaCl，250 mmol/L 咪唑)洗脫，收集酶液。使用AKTA蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)用脫鹽柱(HiTrap Desalting，GE Healthcare)對(duì)純化后的酶液進(jìn)行脫鹽。為了有較好的脫鹽收率和效果，對(duì)每次上樣量進(jìn)行調(diào)整，確定每次上樣量為1.5 mL。脫鹽液用 SDS － PAGE［10］分析純度，并用于后續(xù)測(cè)定。

1.2.3 蛋白含量測(cè)定

蛋白含量采用 Bradford［11］法測(cè)定。

1.2.4 酶比活力測(cè)定

酶活定義為每分鐘催化降解1 μmol 2－氯丙酸生成1 μmol Cl－所需的酶量為1 U。以(S)－2－CPA作為反應(yīng)底物，采用Gly－NaOH緩沖液(pH 9.5)作為緩沖體系。反應(yīng)體系為1 mL，底物終濃度是30 mmol/L，在37 ℃下反應(yīng)0、3、6和10 min。添加1%硝酸終止反應(yīng)，離心去除酶。酶活通過(guò)有機(jī)酸柱液相色譜檢測(cè)底物消耗量方法來(lái)計(jì)算。

采用高效液相色譜Agilent 1100系統(tǒng)和有機(jī)酸柱Bio－Rad HPX－87H(30 cm×7.8 mm)對(duì)R－2－氯丙酸和脫鹵產(chǎn)物乳酸以及底物譜中的2－氯丙酸、乳酸進(jìn)行分析測(cè)定。測(cè)定條件:室溫下，流動(dòng)相為5 mmol/L H2SO4，流速為0.6 mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，進(jìn)樣量為5 μL。2－氯丙酸和乳酸的保留時(shí)間分別為20.86和12.289 min，外標(biāo)法得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)分別為:

Y=40.08x，R2=0.9991(x為2－氯丙酸濃度(mmol/L)，斜率為40.08);

Y=29.71x，R2=0.9997(x為乳酸濃度(mmol/L)，斜率為29.71);

純酶的比酶活按式(1)計(jì)算:

式中:比酶活EA1的單位為U/mg，ΔA為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)紫外吸收峰面積的變化值，V1為反應(yīng)體系的體積(1 mL)，k為標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的斜率，p為酶質(zhì)量濃度(mg/mL)，t為反應(yīng)時(shí)間(min)，V2為酶的體積(mL)。

發(fā)酵液體積酶活按式(2)計(jì)算

式中:比酶活EA2的單位為U/mL，ΔA為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)紫外吸收峰面積的變化值，V1反應(yīng)體系的體積(1 mL)，k為標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的斜率，t為反應(yīng)時(shí)間(min)。

2 結(jié)果與討論

2.1 突變文庫(kù)的構(gòu)建與高通量篩選

以DehDIV－R為模板，在Mg2+濃度為7 mmol/L、Mn2+濃度為0.4 mmol/L的條件下進(jìn)行易錯(cuò)PCR建庫(kù)，隨機(jī)挑取10～20個(gè)菌落送去上海生工測(cè)序，測(cè)得突變率為0.15%。發(fā)現(xiàn)滿(mǎn)足易錯(cuò)PCR建庫(kù)要求，保證大部分的突變含1～2個(gè)突變位點(diǎn)。通過(guò)電轉(zhuǎn)化得到2000多個(gè)突變子，構(gòu)成易錯(cuò)PCR突變文庫(kù)。經(jīng)過(guò)4次篩選得到的突變子庫(kù)如表1所示。

表1 dehDIV-R的突變子庫(kù)Table 1 Mutant library of dehDIV-R

2.2 突變子的純化

控制接種量與誘導(dǎo)條件，盡量使突變子表達(dá)情況同步，結(jié)果如圖1所示。由于DehDIV－R的表達(dá)載體仍為pET30，所以重組蛋白帶有組氨酸標(biāo)記，采用純化策略，純化各個(gè)突變子，純化情況如圖2所示。

圖1 DehDIV-R不同突變子的SDS-PAGE凝膠電泳Fig.1 SDS-PAGE gel electrophoresis of different DehDIV-R mutants

2.3 同源建模與分子對(duì)接

圖2 DehDIV-R突變子E7的蛋白純化Fig.2 Protein purification gel of DehDIV-R mutant E7

為了進(jìn)一步研究所得突變體的結(jié)構(gòu)與功能變化，并且驗(yàn)證和發(fā)展之前對(duì)Asn203位點(diǎn)與手性選擇性關(guān)系的推測(cè)，首先使用 Sybyl中的 advanced protein modeling(APM)模塊對(duì)DehDIV－R進(jìn)行同源建模分析。選取與DehDIV－R相似性最高(序列相似性23.71%)的來(lái)自 Pseudomonas putida PP3的 DehI(PDB:3BJX)酶作為模板，模擬得DehDIV－R的三級(jí)結(jié)構(gòu)如圖3所示。由圖3可知:其Z－score為21.57，可信度為可信(certain)。來(lái)自P.putida PP3的DehI(PDB:3BJX)的預(yù)測(cè)催化機(jī)制是酸性氨基酸活化水分子，從Cl－的相反方向進(jìn)攻底物分子的α－碳原子，從而催化脫鹵。出發(fā)酶DehDIV-R、突變體DehDIVG2、DehDIV－E7與R－2－氯丙酸的對(duì)接結(jié)果分別見(jiàn)圖4。由圖4可知:對(duì)接打分與活化能的對(duì)應(yīng)關(guān)系，計(jì)算得到DehDIV－G2的活化能比DehDIV－R相應(yīng)的下降0.964 kJ/mol，從而使得DehDIV－G2的比酶活提高了25.2%;DehDIV－E7的活化能比DehDIV－R相應(yīng)的下降2.5498 kJ/mol，從而使得DehDIV－E7比酶活提高了38.7%。

圖3 DehDIV-R的三維結(jié)構(gòu)活性位點(diǎn)與底物結(jié)合口袋部分用原子堆積模型標(biāo)出Fig.3 Three-dimensional structure of DehDIV-R active sites combined with substrate pocket part marked by atomic accumulation model

圖4 脫鹵酶與R-2-氯丙酸的分子對(duì)接模型Fig.4 Molecular docking model of dehalogenation enzyme and R-2-CPA

2.4 雙點(diǎn)突變子的酶比活力預(yù)測(cè)

根據(jù)對(duì)突變子庫(kù)中酶比活力提高的突變位點(diǎn)進(jìn)行的綜合分析，發(fā)現(xiàn)單點(diǎn)突變未能獲得酶比活力大幅提高的進(jìn)化酶。因此，進(jìn)一步考察突變雙位點(diǎn)對(duì)酶比活力的影響。根據(jù)突變子DehDIV－E7和DehDIVG2與R－2－氯丙酸的對(duì)接結(jié)果可知，雖然突變位點(diǎn)都與催化殘基位點(diǎn)距離較遠(yuǎn)，但是對(duì)酶催化R－2－CPA有促進(jìn)作用，使得酶與底物的結(jié)合能降低。因此，預(yù)測(cè)2個(gè)突變位點(diǎn)的綜合作用，應(yīng)該可以更大幅度的降低結(jié)合能，提高酶催化活力。通過(guò)SYBYL模建了4種進(jìn)化酶，分別為 Asp272Ser，Asp235Ser;Asp272Val，Asp235Ser;Asp272Ser，Asp235Val 和 Asp272Val，Asp235Val，分別命名為 DehDIV － SS，DehDIV － VS，DehDIV－SV和 DehDIV－VV。在同樣的入口值(Threshold)和膨脹值(Bloat)下，選擇最佳的反應(yīng)口袋，并以此與R－2－氯丙酸對(duì)接，選擇最佳的對(duì)接構(gòu)象，打分結(jié)果如表2所示。上述4個(gè)進(jìn)化酶與R－2－CPA的分子對(duì)接(圖4)。由圖4可和表2可知:活化能比原始酶降低了6.2282、5.7266、5.6848和5.0578 kJ/mol。因此，預(yù)測(cè)上述4個(gè)進(jìn)化酶的酶比活力也會(huì)獲得大幅提高。

易錯(cuò)PCR是在采用DNA聚合酶進(jìn)行目的基因擴(kuò)增時(shí)，通過(guò)調(diào)整反應(yīng)條件來(lái)改變擴(kuò)增過(guò)程中的突變頻率，從而以一定的頻率向目的基因中隨機(jī)引入突變，獲得隨機(jī)突變體［12］。此方法在許多酶的改造上取得了不少的成果［13－14］。而它最關(guān)鍵在于對(duì)何時(shí)突變頻率的選擇，突變頻率太低則會(huì)導(dǎo)致文庫(kù)中野生型群體過(guò)多;突變頻率太高則導(dǎo)致絕大多數(shù)突變?yōu)橛泻ν蛔儯瑹o(wú)法篩到有益突變。

表2 不同突變子的分子對(duì)接打分Table 2 Molecular docking marking of different mutants

3 結(jié)論

通過(guò)調(diào)節(jié)易錯(cuò)PCR體系中Mn2+濃度，調(diào)整突變率，使氨基酸突變維持在1～3個(gè)的最佳范圍內(nèi)?；谌芤?Cl－增加，并通過(guò)與 Hg(SCN)2和Fe(NH4)SO4反應(yīng)會(huì)發(fā)生顏色變化的高通量篩選方法，快速、有效地用于對(duì)水解R－2－CPA具有明顯活力提高的酶突變體的初篩。使用此方法篩選得到有酶比活變化的突變子庫(kù)，并有突變子DehDIVG2和DehDIV－E7的比酶活分別提高25.2%和38.7%，突變后E7比酶活為14.47 U/mg。并通過(guò)SYBYL對(duì)酶與底物進(jìn)行分子對(duì)接，對(duì)接打分顯示，DehDIV－G2的活化能下降 0.9614 kJ/mol，DehDIV－E7的活化能下降2.5498 kJ/mol。由于酶和底物R－2－氯丙酸的活化能下降，親和能力提高，從而提高酶比活力。后續(xù)研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)得到上述模擬的進(jìn)化酶，測(cè)定其具體活力，并結(jié)合計(jì)算機(jī)輔助模擬軟件獲得酶學(xué)性質(zhì)更優(yōu)的突變子。

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