韓 磊,陳 曦,馮進(jìn)輝,吳洽慶,朱敦明
(中國(guó)科學(xué)院 天津工業(yè)生物技術(shù)研究所 工業(yè)酶國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室,天津 300308)
酶因其高選擇性、反應(yīng)溫和等特點(diǎn)而被逐漸地應(yīng)用于綠色化工生產(chǎn)過(guò)程中。醛縮酶能立體選擇性地催化C—C鍵的形成,可作為手性分子工業(yè)合成的重要工具[1]。2-脫氧-d-核糖5-磷酸醛縮酶(2-deoxy-d-ribose 5-phosphate aldolase,DERA,EC 4.1.2.4)是目前發(fā)現(xiàn)的唯一一種乙醛依賴型的醛縮酶。在生物體內(nèi),DERA可逆地催化其天然底物乙醛和d-甘油醛-3-磷酸發(fā)生醛縮反應(yīng)而生成2-脫氧-d-核糖-5磷酸,參與多種微生物的DNA代謝途徑[2]。該酶屬于I類醛縮酶,不需要輔因子,均以一個(gè)保守的賴氨酸為活性位點(diǎn)[3]。
DERA具有較寬的底物譜[4]。除了乙醛外,DERA還能夠以丙醛、丙酮、氟代丙酮作供體[4]。新形成的立體中心的構(gòu)型完全由DERA決定并且通常是S構(gòu)型。DERA是唯一一種能催化乙醛的自縮合或和醛類物質(zhì)之間的交叉縮合的醛縮酶,這使其備受關(guān)注。因?yàn)楣w與受體都是醛,以乙醛作供體的縮合產(chǎn)物也可作為進(jìn)一步縮合的受體底物,從而在醛縮底物上引入多個(gè)手性中心,二次縮合的產(chǎn)物可以生成穩(wěn)定的半縮醛而阻止了進(jìn)一步縮合[5]。該特點(diǎn)使它成為合成多種稀有糖和糖衍生物的有力工具。
連續(xù)縮合產(chǎn)物可以用于合成他汀類藥物(statin)的手性側(cè)鏈前體[6-9],這一反應(yīng)過(guò)程以廉價(jià)的、非手性的材料為底物,具有廣闊的應(yīng)用前景。
隨著對(duì)DERA應(yīng)用價(jià)值的認(rèn)識(shí)不斷加深,越來(lái)越多的編碼DERA的基因(deoC)被克隆、測(cè)序和表達(dá)。這些已報(bào)道的DERA分別來(lái)源于Aeropyrum pernix(登錄號(hào)為 BAA81452,下同)[10]、Escherichia coli K12(CAA26974)[11]、Paenibacillus sp.EA001(ACT313388)[12]、Pyrobaculum aerophilum(AAL63-340)[13],Thermococcus kodakaraensis KOD1(BAC677-08)[14]、Thermotoga maritima(AAD36625)[13]、Yersinia sp.EA015(ACN71238)[15]。然而,通常都存在可溶表達(dá)量低、穩(wěn)定性差以及活力較低的缺點(diǎn)。因此,得到一種高表達(dá)量、高穩(wěn)定性的、高活力的DERA就尤為重要。本研究表達(dá)、純化一種來(lái)自Staphylococcus aureus N315的 DERA(SaDERA),并研究其相關(guān)性質(zhì)。
1.1.1 質(zhì)粒、菌株及主要試劑
pET-28a(+)質(zhì)粒載體和E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自Novagen公司。FastDigest?限制性內(nèi)切酶購(gòu)自Fermentas公司。蛋白胨和酵母提取物均來(lái)自BD公司。Bradford蛋白濃度試劑盒購(gòu)自康世紀(jì)公司??捡R斯亮藍(lán) R250購(gòu)自 Solarbio公司。NADH購(gòu)自Codexis公司。d-2-脫氧核糖-5-磷酸(DR5P)、磷酸丙糖異構(gòu)酶和甘油磷酸脫氫酶混合液(GPD/TPI,來(lái)自兔肌肉組織)購(gòu)自 Sigma-Aldrich公司。40%乙醛水溶液購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)。其余試劑均為市售分析純。
1.1.2 主要儀器設(shè)備
ZHWY-200D恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智城公司);SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái)(蘇凈安泰公司);APV2000高壓勻漿破碎儀(德國(guó)APV公司);RC6+高速冷凍離心機(jī)(Thermo公司)。蛋白純化及全酶相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定均在GE公司的AKTA Purifier 10蛋白分離純化系統(tǒng)上進(jìn)行。SpectraMax? M2e酶標(biāo)儀購(gòu)自Molecular Devices公司;microTOF-QII型質(zhì)譜(MS)分析儀、數(shù)據(jù)采集軟件microTOFcontrol及數(shù)據(jù)處理軟件DataAnalysis均購(gòu)自Bruker公司。
1.2.1 數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘及生物信息學(xué)分析
在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)的蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein)中,以“2-deoxy-d-ribose 5-phosphate aldolase”或“deoxyribose phosphate aldolase”為檢索詞,并以“bacteria”為限定,確定候選的DERA。通過(guò)在ExPASy的ProtParam程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein)上計(jì)算候選酶的理論理化特性,排除含半胱氨酸個(gè)數(shù)較多或是奇數(shù)的(可能影響可溶性)和預(yù)測(cè)可溶性低的。通過(guò)BioEdit分析軟件(版本7.0.9)的 ClusterW 多序列比對(duì),分析候選的DERA的保守序列,最終確定以一種來(lái)自于Staphylococcus aureus N315的DERA為研究對(duì)象(命名為SaDERA),其氨基酸參考序列的登錄號(hào)為BAB43223。
1.2.2 密碼子優(yōu)化和基因合成
通過(guò)在線的jcat密碼子優(yōu)化程序(http://www.jcat.de)對(duì)SaDERA的原始基因序列進(jìn)行了針對(duì)在E.coli中表達(dá)的密碼子優(yōu)化,然后在N端加上了His6標(biāo)簽。在確定了基因兩端的限制酶識(shí)別位之后由上海旭冠生物科技發(fā)展有限公司合成。
1.3.1 工程菌的構(gòu)建
質(zhì)粒的提取、酶切、轉(zhuǎn)化、核酸凝膠電泳、基因的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE等實(shí)驗(yàn)操作均按照文獻(xiàn)[16]進(jìn)行。目的基因構(gòu)建至pET-28a(+)質(zhì)粒載體的NcoI和EcoR I兩酶切位點(diǎn)之間,轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)超級(jí)感受態(tài)細(xì)菌中。
1.3.2 目的酶的表達(dá)純化
將工程菌接入800 mL含終濃度為100 μg/mL的氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中,37℃搖床培養(yǎng)(200 r/min)至 OD600為 1.0時(shí),添加終濃度為 1 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)(4 h、37℃)。離心(4℃、6000 r/min、10 min)收菌,并用4℃預(yù)冷的緩沖液 A(20 mmol/L Tris-HCl、pH 8.0、500 mmol/L NaCl)洗滌菌體,-20℃保存。
以50 mL緩沖液A重懸菌體后,進(jìn)行高壓勻漿破菌,離心(12000 r/min、4 ℃、15 min)除去細(xì)胞碎片。上清液(即粗酶液,簡(jiǎn)稱CFE)在用0.22 μm的濾膜(Millipore)過(guò)濾后通過(guò)HisTrapTMFast Flow層析柱(GE Healthcare,5 mL)進(jìn)行一步純化。用10%緩沖液B(含0.2 mol/L咪唑的緩沖液A)平衡柱子,上樣后用10%的緩沖液B沖洗,待紫外檢測(cè)出現(xiàn)基線時(shí),用10% ~100%的緩沖液B進(jìn)行線性洗脫(6個(gè)體積)。收集合并目的蛋白后,通過(guò)超濾管進(jìn)行濃縮脫鹽并添加終體積分?jǐn)?shù)為10%的甘油。過(guò)膜分裝后,于-80℃保存。
1.4.1 活性分析方法
DERA的活性測(cè)定通過(guò)GPD/TPI耦聯(lián)的方法在酶標(biāo)儀上進(jìn)行。DR5P在DERA催化下裂解產(chǎn)生的G3P能被GPD/TPI還原而消耗NADH,引起340 nm波長(zhǎng)下的吸光度下降(ε =6.22 mmol-1·cm-1)。由于GPD/TPI過(guò)量,此下降速率與G3P的生成速率一致。通常,這個(gè)耦聯(lián)反應(yīng)在25℃下進(jìn)行,反應(yīng)體系:100 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.7)、1 mmol/L的DR5P、2 U的 GPD/TPI和0.35 mmol/L的 NADH 以及適量的SaDERA。吸光度的變化被連續(xù)檢測(cè)5 min以確定初始反應(yīng)速率。1個(gè)酶活力單位(U)被定義為在上述檢測(cè)條件下,每分鐘裂解1 μmol的DR5P而生成1 μmol的G3P所需的酶量。
1.4.2 相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定
SaDERA的相對(duì)分子質(zhì)量及其在溶液中的聚集狀態(tài)通過(guò)SDS-PAGE以及分子篩來(lái)確定。所用分子篩為Superdex 20010/300 GL(GE公司)。流動(dòng)相為含有150 mmol/L NaCl的20 mmol/L磷酸緩沖液(pH 7.4),流速為0.4 mL/min。蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量由標(biāo)準(zhǔn)蛋白的保留體積進(jìn)行計(jì)算得到。標(biāo)準(zhǔn)蛋白分別為Ovalbumin(4.4×104)、Conalbumin(7.5×104)、Conalbumin(1.58 × 105)、Ferritin(4.40 × 105)、Thyroglobulin(6.69×105)。
1.4.3 最適反應(yīng)條件
最適反應(yīng)條件按裂解和縮合的活性分析方法來(lái)測(cè)定。對(duì)于最適反應(yīng) pH,所用緩沖體系(100 mmol/L)為NaAc-HAc(pH 4.0~6.0)、Na2HPO4-NaH2PO4(pH 6.0~7.0)、Tris-HCl(pH 7.0~9.5)和Na2CO3-NaHCO3(pH 9.5~11.0)。對(duì)于最適反應(yīng)溫度,反應(yīng)在25~65℃下進(jìn)行。
1.4.4 動(dòng)力學(xué)參數(shù)
動(dòng)力學(xué)參數(shù)按裂解和縮合的活性分析方法來(lái)測(cè)定,只是DR5P選取不同濃度(0.4~8 mmol/L)。表觀動(dòng)力學(xué)參數(shù)(Km和Vmax)及其誤差由SigmaPlot v12.2的線性擬合功能得到。
1.5.1 pH穩(wěn)定性
對(duì)于pH耐受性,所用緩沖體系與最適pH測(cè)定時(shí)相同。存在于不同pH緩沖液中的酶溶液(0.5 mg/mL)的酶在25℃下溫浴24 h后,測(cè)定其殘存活力。
1.5.2 熱穩(wěn)定性
對(duì)于溫度耐受性,存在于100 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.7)中的酶溶液(0.5 mg/mL)在不同溫度下(4~65℃)溫浴10 min后測(cè)定其殘存活力。為測(cè)定SaDERA在最適反應(yīng)溫度(45℃)下的活力半衰期,小份酶液(20 μL)在不同的時(shí)間點(diǎn)取出并測(cè)定其殘余活力。
1.5.3 乙醛耐受性
為檢測(cè) SaDERA對(duì)乙醛的耐受性,含有100 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.7)和300 mmol/L乙醛的酶溶液(0.5 mg/mL)在25℃下溫浴。在不同的時(shí)間取出小份酶液(20 μL)并通過(guò)微型超濾管(Amicon Ultra 0.5 mL,Ultracel 10k)除去乙醛[13]。在用100 mmol/L Tris-HCl(pH 7.7)稀釋到原體積之后,測(cè)定其殘余活力。
1.6.1 分析方法
薄層層析(TLC)條件:展層劑為乙酸乙酯(EA);顯色劑為茴香醛顯色劑(V(茴香醛)∶V(濃H2SO4)∶V(H2O)=5∶10∶85);火上烘烤顯色。連續(xù)縮合產(chǎn)物2,4,6-三脫氧己糖的比移值約為0.5,顯灰綠色。
MS條件:電噴霧電離源正離子模式(ESI+),選擇反應(yīng)監(jiān)視(SRM)掃描模式,噴霧電壓4.5 kV,霧化氣流量6 L/min,離子傳輸毛細(xì)管溫度180℃,碰撞氣為N2,掃描頻率1.0 Hz。
1.6.2 連續(xù)縮合反應(yīng)及產(chǎn)物鑒定
反應(yīng)溶液(10 mL):100 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH=7.4),0.3 mol/L乙醛,8 mg純酶。反應(yīng)條件:25℃水浴,100 r/min振搖。以TLC監(jiān)視反應(yīng)進(jìn)程,3 d后結(jié)束反應(yīng)。加2倍體積的丙酮終止反應(yīng)后,冰上靜置15 min,離心除去蛋白。40℃下減壓旋蒸反應(yīng)液至1 mL,用制備TLC進(jìn)行純化。刮下的產(chǎn)物用乙酸乙酯(EA)重溶后,過(guò)濾,蒸干。取0.25 mg溶于1 mL milli-Q水中,進(jìn)樣到MS以檢測(cè)其相對(duì)分子質(zhì)量。
SaDERA(登錄號(hào)BAB43223)由220個(gè)氨基酸殘基組成。由ExPASy網(wǎng)站上的ProtParam功能知:SaDERA的理論相對(duì)分子質(zhì)量為2.334×105,理論pI為4.71。氨基酸多序列比對(duì)(圖1)結(jié)果顯示,SaDERA 與 來(lái) 源 于 Paenibacillussp.EA001(PaeDERA)[12],Thermococcus kodakaraensis KOD1(TkDERA)[14]、Yersinia sp.EA015(YerDERA)[15]、Thermotogamaritima(TmDERA)[13]、Pyrobaculum aerophilum (PaDERA)[13]、 Aeropyrum pernix(ApDERA)[10]和 Escherichia coli K12(EcDERA)[11]的 DERAs序列一致性分別為 64.0%、51.7%、51.5%、47.3%、29.0%、28.5%和27.4%。
圖1 SaDERA與已知的DERAs的多序列比對(duì)Fig.1 Multiple sequence alignment for SaDERA and the other reported DERAs
EcDERA中涉及形成Schiff堿調(diào)節(jié)羥醛縮合反應(yīng)的關(guān)鍵殘基(Asp102、Lys167和 Lys201)在SaDERA中完全保守(分別對(duì)應(yīng) Asp89、Lys151和Lys180)。在EcDERA中,Lys167與底物形成Schiff堿,而在立體空間中Lys167接近的Asp102、Lys201涉及供體醛的立體選擇性的質(zhì)子化轉(zhuǎn)移過(guò)程[17]。因此,推斷SaDERA可能具有催化能力。
Desantis等[18]報(bào)道了EcDERA的磷酸結(jié)合口袋由 Gly171、Lys172、Gly204、Gly205、Val206、Arg207、Ser238和Ser239組成。而在SaDERA中,對(duì)應(yīng)的殘基依 次 是 Gly155、Phe156、Gly183、Gly184、Val185、Arg186、Thr200和 Arg201。156(按 SaDERA 編號(hào),下同)位的氨基酸殘基由堿性的Lys置換為疏水的Phe,增加了磷酸結(jié)合口袋的疏水性;238位的氨基酸殘基由Ser置換為鏈更長(zhǎng)的Thr,而增大了磷酸結(jié)合口袋的空間位阻;201位的氨基酸殘基由中性的Ser置換為堿性的Arg,改變了磷酸結(jié)合口袋的靜電環(huán)境。這些改變將使得SaDERA與非磷酸取代的醛類化合物的結(jié)合能力增強(qiáng),從而有助于連續(xù)縮合反應(yīng)的進(jìn)行。
SaDERA具有良好的可溶性,37℃誘導(dǎo)即可表達(dá)出大量可溶蛋白。由圖2可知,由于SaDERA帶了His6標(biāo)簽,通過(guò)一步簡(jiǎn)單的鎳柱純化即可得到電泳純的目的酶(圖2,泳道PE)。
圖2 SaDERA的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of SaDERA
SaDERA純酶的比酶活是118.9 U/mg(表1),是相同條件下來(lái)自PaeDERA的比酶活(62 U/mg)的 2 倍[12]。
通過(guò)凝膠過(guò)濾層析(Superdex 20010/300 GL),SaDERA的保留體積為14.1 mL,因此SaDERA全酶的相對(duì)分子質(zhì)量約為5.57×104。由SDS-PAGE知,其單體相對(duì)分子質(zhì)量為2.55×104,所以該酶在溶液中以同源二聚體形式存在,此結(jié)果與已報(bào)道的DERA的亞基數(shù)一致。
表1 SaDERA的蛋白純化過(guò)程Table 1 Purification of target enzyme
SaDERA的酶學(xué)性質(zhì)分析如圖3所示。由圖3(a)和圖3(b)可知:SaDERA最適反應(yīng)條件為pH 7.7。它能在一個(gè)較寬的pH范圍(6.5~9.5)內(nèi)呈現(xiàn)出相對(duì)較高的反應(yīng)活力(最適活力的80%以上)。另外,SaDERA在相同pH的不同緩沖液下的活性相似,因此,緩沖液的差別對(duì)活性影響不大。
由圖3(c)和圖3(d)可知:SaDERA能穩(wěn)定地存在于中性或偏堿性的環(huán)境中,而且具有相當(dāng)高的堿耐受性,在pH 11.0的緩沖液(100 mmol/L)中25℃溫浴24 h后仍有93%的殘余活力。SaDERA具有良好的耐熱性,在40℃溫浴10 min后能保持幾乎全部活力,然而隨著溫度繼續(xù)升高,其殘余活力逐漸減小。
乙醛耐受性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示,由圖4可知:該酶在0.3 mol/L乙醛濃度下,30 min內(nèi)保持了高于70%的殘余活力,在2 h后,其剩余活力仍大于50%,到達(dá)6 h后剩余活力下降為約40%,其后至24 h不再出現(xiàn)明顯下降。從其活力下降的曲線可以看到,在1 h內(nèi),活力下降速度最高,1 h內(nèi)下降了約60%,但是之后變化逐漸放緩,這表明隨著時(shí)間的延長(zhǎng),大量的乙醛底物被醛縮酶催化生成縮合產(chǎn)物,降低了變性劑乙醛的濃度,進(jìn)而導(dǎo)致酶失活速率的下降。這一結(jié)果與嗜熱來(lái)源的PaDERA和TmDERA相似,并且都遠(yuǎn)優(yōu)于常溫來(lái)源的EcDERA:SaDERA在實(shí)驗(yàn)條件下溫浴2 h后能保持54%的原活力;PaDERA和TmDERA在同樣的條件下溫浴2 h后保持60% ~70%的原活力,EcDERA在同樣的條件下溫浴2 h后幾乎完全喪失活力[12]。這表明SaDERA有潛力替代研究最充分的EcNAL而成為有價(jià)值的工業(yè)催化劑。
圖3 SaDERA的酶學(xué)性質(zhì)分析Fig.3 Characterization of the purified SaDERA
圖4 SaDERA的乙醛耐受性Fig.4 Effects of acetaldehyde on enzyme stability
SaDERA的表觀動(dòng)力學(xué)參數(shù)也被測(cè)定,結(jié)果如表2所示。由表2可知:SaDER的 kcat/Km為175 L/(mmol·s),這與研究最充分的高活力的EcDERA相似[18],而與已報(bào)道的 PaeDERA[12]具有同樣較高的乙醛耐受。這顯示出SaDEAR具有一定的應(yīng)用潛力。
為了進(jìn)一步確定SaDERA的連續(xù)羥醛縮合的性能,以乙醛為底物進(jìn)行了連續(xù)羥醛縮合反應(yīng),并通過(guò)制備TLC進(jìn)行了產(chǎn)物純化和質(zhì)譜檢測(cè)。結(jié)果如圖5所示。由圖5(a)可知:在25℃下反應(yīng)20 h后即有大量產(chǎn)物生成,而EcDERA卻幾乎檢測(cè)不到產(chǎn)物的生成[12]。由圖5(b)可知:產(chǎn)物為2,4,6 - 三脫氧己糖(C6H12O3),即乙醛連續(xù)兩次自縮合的產(chǎn)物,單一同位素的理論質(zhì)荷比(m/z)為132.0786,理論加鈉峰為155.0684,實(shí)測(cè)為155.0640。分離產(chǎn)率39.5%。結(jié)果表明SaDERA具有催化連續(xù)羥醛反應(yīng)的能力,而且明顯優(yōu)于研究最充分的EcDERA。
表2 SaDERA與其他DERAs的表觀動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 2 Apparent kinetics parameters of SaDERA and the other DERAs
圖5 縮合產(chǎn)物鑒定Fig.5 Identification of aldol product
采用基因挖掘技術(shù),一種來(lái)自Staphylococcus aureus N315的DERA被發(fā)現(xiàn)并進(jìn)行了鑒定。SaDERA具有一些明顯的優(yōu)勢(shì),如乙醛耐受性強(qiáng)、耐堿、催化活性高、可溶表達(dá)量高;應(yīng)特別指出的是,SaDERA具有比已商業(yè)化的EcDERA更強(qiáng)的乙醛耐受性以及比其他一些已報(bào)道的DERA更高的比活力或kcat/Km值。SaDERA及構(gòu)建的工程菌有可能成為一種新的工業(yè)催化劑。隨著生物催化技術(shù)應(yīng)用和發(fā)展,獲得寬底物譜、高穩(wěn)定性、高立體選擇性的新型DERA將是今后的研究重點(diǎn)。
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