張海靈，高秀珍，陳 曦，任 杰，馮進輝，張同存，吳洽慶，朱敦明

(1.天津科技大學 生物工程學院，天津 300457;2.中國科學院 天津工業(yè)生物技術(shù)研究所 工業(yè)酶國家工程實驗室，天津 300308)

烯烴的不對稱加氫反應可以同時引入兩個手性中心，在不對稱合成技術(shù)中是非常重要的一類反應，是合成很多精細化工品的必要步驟。目前以金屬催化劑為媒介的金屬催化不對稱加氫反應應用較為廣泛，但是金屬催化過程所需要的金屬催化劑價格昂貴，氫氣易燃易爆，產(chǎn)物中殘留重金屬，產(chǎn)品構(gòu)型受限制等限制了其應用［1－2］，烯酮/烯酯還原酶則是一類可以溫和實現(xiàn)C＝C不對稱還原的生物催化劑，可以與金屬催化互補［3］。目前利用烯酮/烯酯還原酶催化的有價值的反應大都是用全細胞來催化完成的［4－7］。利用微生物細胞雖然可以高立體選擇性地還原多種α，β－不飽和醛或酮，但是對還原C＝C鍵和C＝O鍵的化學選擇性通常較弱，這是因為細胞中還存在醇脫氫酶，從而產(chǎn)生副產(chǎn)物，導致總產(chǎn)率降低［8－9］。為了排除這一干擾，近幾年來人們傾向于對烯酮/烯酯還原酶進行分離純化后從事底物譜及其應用研究，從而最大限度地消除各種副反應的發(fā)生，這不僅增強反應的化學和立體選擇性，而且還大大增加了產(chǎn)率［10－13］。

筆者對Aspergillus oryzae RIB40中的烯酮/烯酯還原酶進行了異源表達，鎳柱純化的蛋白進行酶學性質(zhì)及底物譜的分析。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

米曲霉A.oryzae RIB40，由華南理工大學潘力教授提供;宿主菌大腸桿菌 E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)和克隆載體pUC19，由中國科學院工業(yè)酶國家工程實驗室保存;表達載體pET32a(+)，購自Novagen公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基 (g/L):酵母提取物5，蛋白胨10，葡萄糖 20，KCl 2，KH2PO41，MgSO4·7H2O 0.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02;pH 5.5。

LB培養(yǎng)基(g/L):酵母提取物5，蛋白胨10，NaCl 10;pH 7.0。

抗生素使用質(zhì)量濃度為100 μg/mL，使用氨芐青霉素(Amp)。

1.1.3 主要試劑和儀器

限制性內(nèi)切酶 KpnⅠ、EcoRⅠ、SmaⅠ，購自Fermentas公司;PrimeSTAR HS DNA聚合酶和DNA連接試劑盒，購自TaKaRa公司;RNA酶，購自Sigma公司;DNA凝膠回收試劑盒，購自天根生化科技(北京)有限公司;NAD(P)H和 NAD(P)，購自美國Codexis公司;所有的底物，購自Alfa Aesar或Sigma Aldrich公司;核酸染色劑GelRed，購自Biotium Inc公司;質(zhì)粒提取試劑盒和蛋白定量試劑盒，購自北京康為試劑有限公司。

離心機分別購自美國Eppendorf和Thermo公司;高壓勻漿機，購自德國APV公司;蛋白純化儀和Superdex 20010/300 GL，購自美國GE公司;酶標儀SPECTRAMAX M2e，購自美國MD公司;氣相色譜儀Agilent 7890，購自安捷倫公司;手性柱CP ChiraSil DEX(25 m ×0.25 mm ×0.25 μm)，購自德國Varian 公司。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取

A.oryzae RIB40菌株經(jīng)YPD液體培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d(30℃、200 r/min)后，4000 r/min 4℃離心10 min收集菌體;菌體凍干后液氮研磨成粉末，溶于600 μL 裂解液(50 mmol/L NaOH，1 mmol/L EDTA，1%Triton X－100)中重懸，并加入體積分數(shù)1%β－巰基乙醇;65℃孵育1 h后，12000 r/min離心10 min;上清用酚 －氯仿萃取2次后，異丙醇沉淀DNA，所得DNA沉淀用含有100 μg/mL RNA酶的重蒸水重懸，37℃孵育1 h以便DNA能完全溶解。

1.2.2 基因asper的克隆

根據(jù) A.oryzae RIB40烯酮/烯酯還原酶基因(Genbank ID:XM_001727598.1)序列設(shè)計引物為:5'－GGGGTACCGACGACGACGACAAGGGATCCATCTCTTCCACATC－3'(下劃線部分為KpnⅠ酶切位點，黑體部分為腸激酶酶切位點)和5'－CGGAATTCCTAAAGTGCACGCCAGAACT－3'(下劃線部分為EcoRⅠ酶切位點)。以A.oryzae RIB40基因組DNA為模板，PCR擴增條件為:94℃預變性5 min;98℃，30 s;55℃，45 s;72℃，100 s;30個循環(huán)。擴增產(chǎn)物用含有核酸染色劑GelRed的0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收。純化后的DNA片段連接到pUC19(SmaⅠ單酶切)線性載體上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E.coli DH5α感受態(tài)細胞中，在含有100 mg/L氨芐青霉素、40 mg/L X-gal和100 μmol/L IPTG的LB平板上37℃培養(yǎng)16 h，隨機挑選白色克隆進行PCR驗證。陽性克隆質(zhì)粒進行測序和序列分析，命名為pUC-asper。

1.2.3 asper基因表達載體的構(gòu)建與蛋白AspER的表達純化

重組質(zhì)粒pUC-asper經(jīng)限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和EcoRⅠ消化后連接到同樣內(nèi)切酶消化的pET32a(+)上，得到的重組質(zhì)粒pET32a(+)-asper轉(zhuǎn)入 E.coli DH5α感受態(tài)細胞中，在含有Amp抗性的LB平板上37℃培養(yǎng)，提質(zhì)粒后進行雙酶切驗證，將陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli BL21(DE3)中得到重組工程菌。

將單菌落接種于含有Amp的LB培養(yǎng)液的試管中，37℃培養(yǎng)過夜;以1%接種量接種于含有同樣抗生素的800 mL LB培養(yǎng)基，37℃下200 r/min震蕩培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8時加入0.1 mmol/L IPTG，37℃誘導表達6 h。培養(yǎng)后的菌體在7000 r/min離心15 min的條件收集后洗滌并重懸于緩沖液A(20 mmol/L Tris-HCl pH 7.4，250 mmol/L NaCl)中，高壓勻漿破碎細胞。所得細胞裂解液在4℃下經(jīng)14000 r/min離心30 min后取上清，0.45 μm濾膜過濾后進行親和層析純化目的蛋白，咪唑濃度梯度洗脫獲得目的蛋白。所得目的蛋白進行SDS-PAGE檢測，并根據(jù)蛋白定量試劑盒的操作流程測定蛋白濃度，隨后加入50%甘油保存在－20℃中備用。

1.2.4 酶活測定及動力學參數(shù)測定

AspER酶活性的標準檢測采用微孔板反應，在酶標儀上進行。反應體系總體積為200 μL，包含5 mmol/L 2－環(huán)己烯酮(DMSO溶解)，0.5 mmol/L NADPH和100 μg/mL AspER。反應體系的配制采用20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.4)。反應的發(fā)生以加入NADPH作為啟動。反應通過連續(xù)監(jiān)測25℃下340 nm吸光值的變化來測定酶對底物的活性大小。NADPH摩爾消光系數(shù)為6.22/(mmol·cm)。一個酶活力單位(U)定義為每分鐘內(nèi)消耗1 μmol NADPH所需的酶量。

AspER對底物2－環(huán)己烯酮的動力學參數(shù)測定方法同樣按照上述酶活分析方法進行。2－環(huán)己烯酮的濃度范圍設(shè)定為0.1～10 mmol/L。反應速度定義為每分鐘消耗NADPH的毫摩爾數(shù)。采用雙倒數(shù)法計算Km和Vmax。

1.2.5 酶聚集狀態(tài)的確定

AspER在天然狀態(tài)下的聚集狀態(tài)通過結(jié)合分子排阻來進行確定。所用層析柱為Superdex 20010/300 GL，流動相為50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(含有150 mmol/L NaCl)。標準蛋白為:Ovalbumin(4.3 ×104)，Conalbumin(7.5 ×104)，Conalbumin(1.58 ×105)，F(xiàn)erritin(4.4×105)，Thyroglobulin(6.69×105)。根據(jù)標準蛋白與目的蛋白的保留體積推算AspER的相對分子質(zhì)量。

1.2.6 pH和溫度對酶活的影響

通過測定不同pH緩沖液中AspER的酶活，確定該蛋白的最適pH。采用的緩沖液分別為檸檬酸－磷酸緩沖液(pH 2.2～8.0)和Tris-HCl緩沖液(pH 7.2～9.4)。最適反應溫度則是通過測定不同溫度下的酶活確定，溫度范圍為25～45℃，5℃為一個間隔。為了探究其溫度穩(wěn)定性，一定濃度的蛋白溶液在不同溫度下孵育100 min，每20 min取樣1次(第一次取樣時孵育10 min)，檢測蛋白在25℃下的殘余酶活力(以孵育前的酶活力為100%)。所有測定方法均按照1.2.4標準酶活測定條件測定上述不同條件的酶活，每個反應3個平行。

1.2.7 底物譜分析

按照1.2.4酶活測定方法對實驗室現(xiàn)有的α，β－不飽和羰基等化合物進行酶活性檢測以探究AspER的底物譜?？紤]到底物水溶性差，所有的底物均溶解到二甲基亞砜(DMSO)體積分數(shù)1%中，其他成分溶解在pH 7.0磷酸鹽緩沖液。

1.2.8 底物轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物 e.e.(或 d.e.)值的測定

AspER對有活性的手性底物的立體選擇性的分析采用葡萄糖脫氫酶耦聯(lián)的輔酶再生體系進行。1 mL反應體系(100 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.0)中包含:葡萄糖9 mg，D－葡萄糖脫氫酶1 mg，β－NADP 1 mg，AspER 150 μg，底物 2 mg。設(shè)置的反應在37 ℃、200 r/min的條件下反應24 h后用相同體積的甲基叔丁基醚萃取，所得有機相用無水硫酸鈉干燥后氣相色譜儀檢測底物轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物 e.e.(或 d.e.)值。

2 結(jié)果和討論

2.1 AspER的表達和純化

考慮到蛋白可溶表達及純化的需要，在載體構(gòu)建過程中采用了pET32a(+)上的His-tag和Trx-tag。AspER，在E.coli BL21(DE3)中以可溶形式表達，經(jīng)Ni-NTA純化，蛋白純度提高 1.9倍，回收率為60.62%;洗脫后的蛋白經(jīng)腸激酶切除N端融合表達的標簽后，總活力提高到53.265 U(表1)，比純化前和純化后未切除N端標簽時都高，因此認為蛋白N端融合表達的標簽影響了蛋白的活性［14］。根據(jù)蛋白的氨基酸殘基數(shù)預測蛋白單體大小為47.1×103，與SDS-PAGE檢測結(jié)果(圖1)近似。根據(jù)分子篩凝膠層析結(jié)果推算，AspER的相對分子質(zhì)量為9.1×104，由此可推斷該酶以二聚體形式存在。當以NADPH作為輔酶時，酶的活力約為NADH作為輔酶時酶活力的8倍，說明AspER為依賴于NADPH的氧化還原酶。

表1 AspER的純化結(jié)果Table 1 Purification of AspER

圖1 AspER的SDS-PAGE檢測結(jié)果Fig.1 SDS-PAGE of AspER

2.2 酶的最適反應pH、溫度和溫度穩(wěn)定性

圖2為AspER酶的最適反應pH、溫度及溫度穩(wěn)定性結(jié)果。由圖2可知:以2－環(huán)己烯酮為底物，AspER在pH 7.0～8.0時表現(xiàn)出了最高活性，低于pH 5.0的條件下酶完全失活(圖2(a))。酶的最適反應溫度及溫度穩(wěn)定性方面，AspER在40℃表現(xiàn)出了最高活性(圖2(b))，在25～40℃范圍孵育100 min后酶活穩(wěn)定，而在45℃ 孵育10 min后酶活失去將近40%，40 min后酶基本完全失活(圖2(c))。

2.3 酶促動力學參數(shù)測定

根據(jù)雙倒數(shù)圖(圖3)計算AspER對2－環(huán)己烯酮的Km和kcat分別為(2.45±0.36)mmol/L和(4.4±0.4)×103s－1。文獻報道已知烯酮/烯酯還原酶對2－環(huán)己烯酮的 Km為 0.01 ～ 5.5 mmol/L［15－19］。AspER對2－環(huán)己烯酮的Km和kcat與來源于Lactobacillis casei str.Zhang 的烯酮/烯酯還原酶(LacER)相近，LacER是NADH依賴型，而AspER更傾向于以NADPH為輔酶［22］。

2.4 酶的底物特異性

用純化后的AspER對不同種類的α，β－不飽和羰基化合物(醛類、環(huán)酮類、馬來酰亞胺及其衍生物、羧酸和酯等)進行了底物譜篩選。以AspER對2－環(huán)己烯酮的比活定義為100，計算該酶對所有底物的相對酶活(表2)。由表2可知:AspER可以催化環(huán)狀烯酮的C＝C雙鍵的還原，環(huán)上取代基的位置對催化活性有很大的影響，如2－甲基環(huán)戊烯酮可以被還原，而對3－甲基環(huán)戊烯酮則沒有活性。該酶對脂肪族的醛和酮有催化活性，但不能催化苯基取代的α，β－不飽和醛、酮、羧酸及其酯的C＝C雙鍵的還原。AspER對馬來酰亞胺及其衍生物有較高的活性，取代基的位置及大小對酶活有不同程度的影響。AspER對溴代馬來酰亞胺和溴代馬來酸酐，以及對苯基馬來酰亞胺和苯基馬來順酐有相似的活性;但對馬來酰亞胺和2－甲基馬來酰亞胺都有較高的活性，而對馬來酸酐和2－甲基馬來酸酐卻沒有活性。至于AspER對馬來酰亞胺和馬來酸酐表現(xiàn)出如此有趣現(xiàn)象的原因，目前還不清楚。

圖2 pH和溫度對AspER酶活的影響及酶活穩(wěn)定性(以2-環(huán)己烯酮為底物)Fig.2 Effects of pH and temperature on AspER enzyme activities and its stabilities

圖3 雙倒數(shù)作圖法計算AspER酶促動力學參數(shù)Fig.3 Lineweaver-Burk plot of AspER

?

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2.5 轉(zhuǎn)化率和 e.e.(或 d.e.)值分析

用AspER對少數(shù)幾個有活性的α，β－不飽和羰基化合物做了催化反應，以標準底物和消旋體產(chǎn)物為對照，用氣相色譜儀檢測了它們的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物的 e.e.(或 d.e.)值［20］(表 3)。由于 2 － 甲基環(huán)戊烯酮產(chǎn)物的消旋體保留時間接近，不能將它們分開，所以無法確定底物轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物e.e.值;由于沒有溴代馬來酸酐的消旋體，所以沒有檢測溴代馬來酸酐的反應結(jié)果。由表3看出:AspER對2－甲基馬來酰亞胺具有較高的轉(zhuǎn)化率和立體選擇性(e.e.值均高于99%);對R－香芹酮的轉(zhuǎn)化率高于S－香芹酮，但具有近似的立體選擇性;對2－苯基馬來酰亞胺的轉(zhuǎn)化率雖然較高，但立體選擇性較低。

表3 AspER催化還原反應的立體選擇性Table 3 Stereoselectivity of bioreduction catalyzed by AspER

3 結(jié)論

以米曲霉(Aspergillus oryzae)RIB40基因組DNA為模版，成功克隆、表達和分離純化出一種烯酮/烯酯還原酶AspER。該酶可以利用 NADH和NADPH作為輔酶，但對NADPH有較高的偏好性。AspER對馬來酰亞胺及其衍生物表現(xiàn)出較高的催化活性，催化2－甲基馬來酰亞胺的高效立體選擇性還原(轉(zhuǎn)化率和e.e.值均高于99%)，目前烯酮/烯酯還原酶催化馬來酰亞胺及其衍生物的還原的研究還很少，AspER可望應用于該類化合物的不對稱還原。

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