徐 沖，關(guān)艷麗，馮 敏

(遼寧省微生物科學(xué)研究院，遼寧 朝陽(yáng) 122000)

果膠酶是指分解果膠質(zhì)的酶，是含有多種組分的復(fù)合酶。果膠酶可裂解單糖之間的糖苷鍵，并脫去水分子，分解包裹在植物表皮的果膠，促使植物組織的分解［1］。這類(lèi)酶廣泛分布于高等植物和微生物中，在某些原生動(dòng)物和昆蟲(chóng)中也有發(fā)現(xiàn)。在微生物中，細(xì)菌、放線菌、酵母和霉菌都能代謝合成果膠酶。果膠酶在工業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域是一種重要的新興酶類(lèi)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前果膠酶在全世界食品酶的銷(xiāo)售額中占25%。主要應(yīng)用于食品工業(yè)的果汁加工和果汁果酒澄清、飼料工業(yè)以及造紙工業(yè)的紙漿脫膠和麻類(lèi)［2］加工。國(guó)內(nèi)關(guān)于果膠酶的研究主要集中在菌種選育、生產(chǎn)工藝和應(yīng)用工藝的改進(jìn)等方面，果膠酶制劑的產(chǎn)量和質(zhì)量還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足工業(yè)生產(chǎn)的需要。篩選果膠酶高產(chǎn)菌株仍是亟待研究的課題［3］。本研究主要針對(duì)產(chǎn)果膠酶菌株進(jìn)行了初步篩選并對(duì)初篩菌株進(jìn)行了拮抗試驗(yàn)。以期為后續(xù)應(yīng)用研究提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 采集自遼寧省朝陽(yáng)市郊果園土壤及腐爛的蘋(píng)果、梨、棗等水果的腐爛部分。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑 果膠瓊脂培養(yǎng)基［4］:K2HPO41 g，MgSO40.5 g，NaNO33 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，果膠 2 g，瓊脂 15 g，蒸餾水 1000 mL，pH 5.5(用于初篩);PDA培養(yǎng)基:用于菌株的純化及保存;真菌種子培養(yǎng)基:PDA液體培養(yǎng)基;真菌發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖5 g，酵母膏1 g，蛋白胨0.5 g，蒸餾水 100 mL，pH 5.5;細(xì)菌種子培養(yǎng)基:LB培養(yǎng)基;細(xì)菌發(fā)酵培養(yǎng)基:K2HPO40.2 g，MgSO40.25 mg，(NH4)2SO40.2 g，MnSO4·H2O 3 g，NaCl 0.03 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.75 mg，桔皮粉 1 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.0。試劑:剛果紅、十六烷基三甲基溴化銨，均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)果膠酶菌株的分離及純化 ①菌種分離:采用稀釋平板法。菌液的制備:準(zhǔn)確稱取0.5 g樣品，放入已滅菌的、裝有玻璃珠和50 mL無(wú)菌水的三角瓶中，置于振蕩器上振蕩20 min，使細(xì)胞分散，即成10－2稀釋液，用移液器吸取1 mL移于裝有9 mL無(wú)菌水的試管中，混合均勻，即成10－3稀釋液，以此類(lèi)推，連續(xù)稀釋成 10－4、10－5、10－6、10－7稀釋液［5］。平板涂布:先將果膠瓊脂培養(yǎng)基熔化后趁熱倒入無(wú)菌平板中，待凝固后編號(hào)，用移液器(槍頭滅菌)吸取0.1 mL菌液接種在瓊脂平板上(每個(gè)梯度設(shè)置3次重復(fù))。用無(wú)菌刮鏟將菌液涂抹均勻。將平板置于30℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)，至菌落長(zhǎng)出后即可分離;②菌種純化 :細(xì)菌采用平板劃線法。真菌純化采用點(diǎn)接，將分離平板上目的菌落的邊緣菌絲用滅菌的移植針挑取小塊放于培養(yǎng)基中央部分。

1.2.2 產(chǎn)果膠酶菌株的初步篩選 ①十六烷基三甲基溴化銨沉淀法:將純化的菌株點(diǎn)接至果膠瓊脂培養(yǎng)基平皿中，置于30℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。取出測(cè)量各菌落直徑。然后在無(wú)菌條件下注入8～10 mL(已滅菌)的1%十六烷三甲基溴化銨，靜置5～8 min，挑選透明圈明顯且透明圈與菌落直徑之比大的菌落進(jìn)行復(fù)篩［6］;②剛果紅染色法:將純化的菌株點(diǎn)接入果膠瓊脂培養(yǎng)基平皿中，置于30℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。取出測(cè)量各菌落直徑。然后在培養(yǎng)皿中加入濃度為1 mg/mL剛果紅染色液染色約40 min，倒掉剛果紅染色液，用少量蒸餾水蕩去薄層表面剛果紅，加入蒸餾水靜止脫色10 min。對(duì)光即可見(jiàn)明顯的絳紅色水解圈。挑選水解圈與菌落直徑之比大于3的菌落進(jìn)行復(fù)篩。

1.2.3 果膠酶產(chǎn)生菌的復(fù)篩 將初篩得到的菌株接種到種子瓶，30℃，200 r/min培養(yǎng)24 h后，將種子液以10%的接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃，200 r/min培養(yǎng)24 h，離心取上清液測(cè)酶活。酶活測(cè)定方法:采用3，5-二硝基水楊酸法(DNS法)。向15 mL具塞試管中加入0.8 mL 1.0%的果膠溶液，放置于50℃水浴中保溫3 min，加入稀釋后的發(fā)酵上清液0.2 mL，反應(yīng)10 min，再加入DNS試劑3 mL，混合均勻，沸水浴10 min后立即冷卻并定容至15 mL，于540 nm處測(cè)定吸光值?？瞻讓?duì)照用煮沸失活的發(fā)酵上清液代替?；盍挝欢x:每分鐘水解果膠產(chǎn)生1 μg還原糖(以半乳糖醛酸計(jì))所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位(U)。

2 結(jié)果與分析

2.1 果膠酶產(chǎn)生菌的初篩結(jié)果

因果膠瓊脂培養(yǎng)基中果膠為唯一碳源，在此培養(yǎng)基上可生長(zhǎng)的菌落均有能力產(chǎn)生果膠酶，但因該培養(yǎng)基果膠用量小，無(wú)法定量判斷哪種微生物產(chǎn)果膠酶能力強(qiáng)。需要對(duì)初步分離純化的菌株進(jìn)行定性篩選。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)采用了2種方法。2種方法測(cè)定分離菌株產(chǎn)果膠酶能力見(jiàn)圖1和表1。通過(guò)比較可以看出采用剛果紅染色法比較直觀，易于觀察。水解(或透明)圈與菌落直徑之比大者一般有較高的果膠酶活力，可作為果膠酶產(chǎn)生菌的定性篩選方法。通過(guò)2種方法挑選出菌株G13、G14、G16、G24、G25 進(jìn)行復(fù)篩試驗(yàn)。

圖1 2種方法測(cè)定分離的菌落透明圈情況Fig.1 Colony transparent circle of separation and determination of two methods

表1 2種方法的比較結(jié)果Table 1 The comparison results of two methods

2.2 果膠酶產(chǎn)生菌的復(fù)篩結(jié)果

通過(guò)對(duì)搖瓶發(fā)酵的上清液進(jìn)行了酶活測(cè)定，通過(guò)試驗(yàn)結(jié)果(表2)可以看出，細(xì)菌菌株G16和G25的酶活高于其他菌株，酶活力分別達(dá)到了6.37萬(wàn) U/mL和6.84萬(wàn)U/mL。

表2 果膠酶產(chǎn)生菌復(fù)篩結(jié)果Table 2 Secondary screening of producing pectinase strains

3 討論

目前我國(guó)用于規(guī)?；a(chǎn)的果膠酶菌株以黑曲霉為主，生產(chǎn)的方式主要是固態(tài)發(fā)酵。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外在細(xì)菌產(chǎn)生的果膠酶的菌種篩選、工業(yè)發(fā)酵條件優(yōu)化、基因工程方面都有研究，促進(jìn)了果膠酶在許多領(lǐng)域的應(yīng)用。細(xì)菌繁殖快，液體發(fā)酵周期短，產(chǎn)果膠酶多呈堿性且熱穩(wěn)定性好，不僅能夠縮短工業(yè)生產(chǎn)周期，而且能用于深層液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)果膠酶，比固態(tài)發(fā)酵更容易控制，同時(shí)降低生產(chǎn)成本，提高了產(chǎn)品的質(zhì)量，更利于環(huán)境保護(hù)。

［1］陳清華，何永良.酶制劑在飼料生產(chǎn)中的應(yīng)用探討［J］.畜牧市場(chǎng)，2006，(10):41-43.

［2］葛菁萍，平文祥，高原，等.一株果膠酶產(chǎn)生菌HDYM-02的分離鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析［J］.微生物學(xué)雜志，2008，28(6):44-47.

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［5］趙斌，何紹江.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)［M］.北京:科學(xué)出版社，2002:85-87.

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