楊舒文，趙 蓓，遲 翔，李金陽，陳玉香，2*

(1.吉林大學(xué)生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，吉林 長春 130022;2.吉林大學(xué)工程仿生教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春 130022)

秸稈是農(nóng)作物經(jīng)收獲籽實(shí)、加工后的剩余物，其主要成分為纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等有機(jī)質(zhì)［1］，農(nóng)作物光合作用生物產(chǎn)量的60%都存在于其中，因此蘊(yùn)藏著豐富的能量。目前我國秸稈資源并沒有得到合理有效的利用［2］，絕大部分被就地焚燒，造成了嚴(yán)重的能源浪費(fèi)和環(huán)境污染。在能源危機(jī)的大背景下，生物質(zhì)燃料的研發(fā)與生產(chǎn)日益受到重視，秸稈作為一種新型清潔的可再生能源［3］，具有潛在優(yōu)勢，探索高效降解秸桿的途徑是有效利用秸桿類生物資源的前提。自然界中細(xì)菌、真菌、放線菌等微生物都可以分解利用秸稈類木質(zhì)纖維素。研究表明，好氧細(xì)菌產(chǎn)生的纖維素酶組分較為單一，并且在自然界中含量較少;厭氧細(xì)菌所占比例較大但生長困難［4］。厭氧真菌可產(chǎn)生一個獨(dú)特的多酶復(fù)合體系，在纖維素降解過程中具有較強(qiáng)優(yōu)勢［5］。因此現(xiàn)在研究的多為真菌，例如使用綠色木霉產(chǎn)生的纖維素酶進(jìn)行纖維素的酶解糖化在美國已實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)［6］。目前國內(nèi)外主要研究單一菌株產(chǎn)纖維素酶的能力［7］，在自然界中，木質(zhì)纖維素是在各種微生物的協(xié)同作用下被降解利用的，因此在選擇菌種時應(yīng)充分考慮菌株之間的協(xié)同作用，發(fā)揮菌系的優(yōu)勢。另外，國內(nèi)外對纖維素酶及木聚糖酶的研究都已經(jīng)相對充分［8］，而對于降解半纖維素側(cè)鏈中乙?；囊阴ｕッ秆芯枯^少。由于木質(zhì)纖維素通常高度乙?；罅旷ユI而形成空間位阻，阻礙了纖維素酶、半纖維素酶與底物的結(jié)合［9］，而乙酰酯酶可以催化水解乙酰基與半纖維素分子間形成的酯鍵，有利于破壞植物細(xì)胞壁的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，同時對其他糖苷水解酶發(fā)揮作用起到促進(jìn)作用［10］。在反芻動物的瘤胃液中，微生物分泌的乙酰酯酶，已被證明是消除飼料細(xì)胞壁中半纖維素交聯(lián)酯鍵的關(guān)鍵酶［11］，并可以與纖維素酶、木聚糖酶協(xié)同作用，最大程度地利用自然界中的纖維類粗飼料資源［12］。課題組以瘤胃微生物為研究對象，構(gòu)建了一組真菌菌系。本文研究了該菌系產(chǎn)生的乙酰酯酶的酶學(xué)性質(zhì)，旨在為乙酰酯酶的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 瘤胃液取自吉林省皓月集團(tuán)。將保溫瓶預(yù)先滅菌，收集新鮮屠宰的肉牛瘤胃液，經(jīng)4層紗布過濾后低溫保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)所用化學(xué)試劑均為分析純。

1.1.2 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基:每1 L含NaHCO35 g，葡萄糖 1 g，酵母膏 1 g，蛋白胨 1 g，L-半胱氨酸鹽酸鹽1.5 g，無細(xì)胞瘤胃液170 mL，緩沖液330 mL(A液、B液各165 mL);產(chǎn)酶培養(yǎng)基:每1 L含NaHCO35 g，酵母膏1 g，蛋白胨1 g，L-半胱氨酸鹽酸鹽1.5 g，無細(xì)胞瘤胃液170 mL，緩沖液330 mL(A液、B液各165 mL);緩沖液(pH為6.8):由A、B液組成，其中每1 L A液含KH2PO43 g，CaCl2·2H2O 0.4 g，NaCl 6 g，MgSO4·7H2O 0.6 g，(NH4)2SO43 g。每1 L B液含K2HPO4·3H2O 4 g;無細(xì)胞瘤胃液的獲取:4層紗布過濾的新鮮牛瘤胃液，于4000 r/min，4℃離心30 min后取上清，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 乙酰酯酶活力分析 將厭氧真菌菌系接種在種子培養(yǎng)基，置于厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)39℃培養(yǎng)3 d。將活化后的菌系接種在發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基上。以無菌蒸餾水代替厭氧真菌菌系接種于培養(yǎng)基中同步培養(yǎng)作為空白對照。每天定時取樣測定酶活力，連續(xù)7 d，分析乙酰酯酶活力動態(tài)變化。乙酰酯酶酶活力測定方法如下:于4℃、2000×g條件下將發(fā)酵液離心，得到的上清即為粗酶液。將2 mmol/L對-硝基苯乙酯、50 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH 7.0)和經(jīng)適當(dāng)稀釋的粗酶液于39℃下保溫15 min 后，50 μL 粗酶液中加入 50 μL 對-硝基苯乙酯和100 μL磷酸鈉緩沖液，39℃下反應(yīng)30 min，然后檢測415 nm下的吸光度，依據(jù)對-硝基苯標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出乙酰酯酶活力。1個酶活力單位(U)定義為在上述反應(yīng)條件下，1 min內(nèi)每1.0 mL酶液將1 μmol對-硝基苯從對-硝基苯乙酯中釋放出來所需的酶量。

1.2.2 測定乙酰酯酶最適溫度 將1.2.1中的反應(yīng)溫度用31、33、35、37、39、41 和 43 ℃替代，測出各溫度下乙酰酯酶的活力大小，并且計算出相對酶活力。

1.2.3 測定乙酰酯酶最適pH 將1.2.1中使用的緩沖液用 pH 4.0～5.0檸檬酸鈉緩沖液(50 mmol/L)，pH 6.0 ～8.0 磷酸鈉緩沖液(50 mmol/L)和 pH 9.0～10.0甘氨酸-NaOH 緩沖液(50 mmol/L)替代，測出各pH下乙酰酯酶活力，并計算相對酶活力。

1.2.4 金屬離子對乙酰酯酶活力影響 將4.0 mmol/L CoCl2、FeCl3、MgSO4、NiCl2、KCl、FeSO4和CaCl2儲液和相同體積的粗酶液混合，39℃保溫30 min后，測定乙酰酯酶活力，并計算相對酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙酰酯酶活力動態(tài)分析

圖1為乙酰酯酶活力動態(tài)分析。由圖1可知，乙酰酯酶活力先持續(xù)增大，在第3天時達(dá)到最高酶活力0.96 U/mL，到第4天時開始下降?？傏厔菖c陳靜等［13］報道的瘤胃液中分離得到的細(xì)菌菌株RB1所產(chǎn)乙酰酯酶活力動態(tài)變化相似，但是其最大酶活力低于該厭氧菌系。曹陽春等［14］報道的瘤胃厭氧真菌Neocallimastix frontalis所產(chǎn)的乙酰酯酶活力最高為0.165 U/mL，也低于該厭氧菌系最高酶活力。這表明真菌菌系相對于單一菌株具有更高的產(chǎn)酶活力。

圖1 乙酰酯酶活力動態(tài)Fig.1 Time courses of acetyl esterase

2.2 乙酰酯酶的最適溫度

溫度對乙酰酯酶活力的影響如圖2所示。由圖2可知，乙酰酯酶的最適溫度為41℃。菌株RB1乙酰酯酶的最適溫度為40℃［11］，瘤胃厭氧真菌Orpinomyces sp.PC-2乙酰酯酶的最適溫度為30℃［15］。比較可以看出，來自瘤胃液中的不同微生物所產(chǎn)乙酰酯酶的最適溫度差別較大。

圖2 溫度對乙酰酯酶活力的影響Fig.2 Effect of temperature on the activity of acetyl esterase

2.3 乙酰酯酶的最適pH

pH對乙酰酯酶活力影響如圖3所示。由圖3可知，該厭氧真菌菌系所產(chǎn)的乙酰酯酶最適pH為9.0，耐受pH值范圍較窄。在pH低于6時，酶活力基本喪失，在pH 7.0時，相對酶活力為22%，pH 10.0時，相對酶活力為16%。在對Streptomyces sp.PC22的研究表明，所產(chǎn)乙酰酯酶的最適 pH范圍為6.5～7.0［7］。菌株 RB1所產(chǎn)乙酰酯酶最適pH為8.0，略低于該真菌菌系所產(chǎn)乙酰酯酶的最適pH［9］。對瘤胃真菌菌株Neocallimastix sp.YQ2的研究顯示，所產(chǎn)乙酰酯酶最適pH為8.0，低于本研究中乙酰酯酶最適pH［16］。不同來源的乙酰酯酶的最適 pH明顯不同。

圖3 pH對乙酰酯酶活力的影響Fig.3 Effect of pH on the activity of acetyl esterase

2.4 各種金屬離子對乙酰酯酶活力影響

金屬離子對乙酰酯酶的影響如表1所示。由表1可知，Mg2+、K+、Ca2+對酶有一定的激活作用，其中Mg2+對乙酰酯酶的促進(jìn)作用最明顯;而Co2+、Ni2+、Fe2+對酶有一定的抑制作用，其中Fe3+幾乎完全抑制酶的活力。Degrassi等［17］研究了金屬離子對Bacillus pumilus所產(chǎn)乙酰酯酶活力影響，10 mmol/L 的 Cu2+、Zn2+、Mn2+、Co2+、Ca2+明顯抑制其活力，而 2 mmol/L時沒有影響。Chungool等［11］研究 Streptomyces sp.PC22 在純培養(yǎng)液中所產(chǎn)生的乙酰酯酶，發(fā)現(xiàn)0.1 mmol/L的Zn2+和 Cu2+抑制乙酰酯酶的活力，但 Mn2+、Ca2+、Co2+、Mg2+和 Ca2+沒有明顯的促進(jìn)或抑制作用。說明不同來源的乙酰酯酶的酶學(xué)特性存在一定差異，綜合文獻(xiàn)報道及本文研究結(jié)果，Ca2+表現(xiàn)出激活或者抑制作用，而Co2+均表現(xiàn)為抑制作用。

表1 金屬離子對乙酰酯酶活力影響Table 1 Effect of metal ions on the activity of acetyl esterase

3 討論

本研究采用厭氧培養(yǎng)牛瘤胃液厭氧真菌菌系，對該菌系所產(chǎn)乙酰酯酶粗酶液，進(jìn)行硫酸銨分級沉淀、透析、離子交換層析、凝膠過濾得到純化后的乙酰酯酶，研究其酶學(xué)性質(zhì)。由酶活力動態(tài)分析得出乙酰酯酶在產(chǎn)酶培養(yǎng)基培養(yǎng)至第3天酶活力達(dá)到最高，最高酶活力為0.96 U/mL，與其他文獻(xiàn)對比得知，該菌系所產(chǎn)乙酰酯酶活力較高。該乙酰酯酶最適溫度為41℃，最適pH為9.0，Mg2+、K+、Ca2+對酶有一定的激活作用，F(xiàn)e3+對酶有很強(qiáng)的抑制作用。乙酰酯酶是消除細(xì)胞壁中半纖維素交聯(lián)酯鍵的關(guān)鍵酶，與纖維素酶、木聚糖酶等具有協(xié)同作用，從而最大限度地降解木質(zhì)纖維素物質(zhì)，在降解含有大量乙酰木聚糖的農(nóng)業(yè)有機(jī)廢棄物過程中具有潛在的應(yīng)用價值。

［1］王仁佑，曾光明，郁紅艷，等.木質(zhì)素的微生物降解機(jī)制［J］.微生物學(xué)雜志，2008，28(3):59-63.

［2］李海濤，姚開，賈冬英，等.我國秸稈資源利用及其木質(zhì)素降解特性［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，30(29):16377-16378，16394.

［3］畢于運(yùn).秸稈資源評價與利用研究［D］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士論文，2010:13-16.

［4］顧方源，陳朝銀，石家驥，等.纖維素酶的研究進(jìn)展及發(fā)展趨勢［J］.微生物學(xué)雜志，2008，28(1):83-87.

［5］朱偉云，毛勝勇，王全軍，等.厭氧真菌體外發(fā)酵篩選技術(shù)的研究［J］.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2001，24(3):44-48.

［6］王士強(qiáng)，顧春梅，趙海紅.木質(zhì)纖維素生物降解機(jī)理及其降解菌篩選方法研究進(jìn)展［J］.華北農(nóng)學(xué)報，2010，25(增刊):313-317.

［7］岳群，曹陽春.荷斯坦閹牛瘤胃液中阿魏酸酯酶和乙酰酯酶的酶學(xué)特性研究［J］.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2011，16(1):73-78.

［8］鄧天福，程夢林，莫建初.木質(zhì)纖維素降解酶的應(yīng)用及前景［J］.中國農(nóng)學(xué)報，2010，26(14):82-85.

［9］Kimura S，Kondo T.Recent progress in cellulose biosynthesis［J］.Journal of Plant Research，2002，115(4):297-302.

［10］Caroline O，Degan FD，Bodil J，et al.Expression of mung bean pectin acetyl esterase in potato tubers:effect on acetylation of cell wall polymers and tuber mechanical properties［J］.Planta，2012，236(1):197.

［11］Chungool W，Thongkam W，Raweesri P，et al.Production，purification，and characterization of acetyl esterase from Streptomyces sp.PC22 and its action in cooperation with xylanolytic enzymes on xylan degradation［J］.World Journal of Microbiology and Biotechnology，2008，(4):549-556.

［12］Subramaniyan S.Isolation，Purification and Characterisation of Low Molecular Weight Xylanase from Bacillus pumilus SSP-34［J］.Applied Biochemistry and Biotechnology，2012，166(7):1831-1842.

［13］陳靜，邢巖，周皓芹，等.一株產(chǎn)乙酰酯酶細(xì)菌篩選、鑒定及酶學(xué)性質(zhì)研究［J］.微生物學(xué)通報，2012，39(6):781-788.

［14］曹陽春，楊紅建，沈博通.高產(chǎn)纖維降解酶牦牛瘤胃厭氧真菌分離株的篩選與鑒定［J］.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2010，15(3):70-74.

［15］Blum DL，Li XL，Chen HZ，et al.Characterization of an acetyl xylan esterase from the anaerobic fungus Orpinomyces sp.strain PC-2［J］.Applied and Environmental Microbiology，1999，65(9):3990-3995.

［16］Yue Q，Yang HJ，Cao YC，et al.Feruloyl and acetyl esterase production of an anaerobic rumen fugus effected by glucose and soluble nitrogen supplementations and its potential in the hydrolysis of fibrous feedstuffs［J］.Animal Feed Science and Technology，2009，154:218-227.

［17］Degrassi G，Okeke BC，Bruschi CV，et al.Purification and characterization of an Acetyl Xylan Esterase from Bacillus pumilus［J］.Applied and Environmental Microbiology，1998，64(2):789-792.