張春艷，包永睿，2，孟憲生，2* ，王 帥，2

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連 116600;2.遼寧省現(xiàn)代中藥研究工程實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116600)

大腸埃希菌是醫(yī)院內(nèi)感染常見的條件致病菌，不僅可黏附于醫(yī)療裝置(如留置導(dǎo)尿管、氣管內(nèi)插管等)形成生物被膜(BF)相關(guān)的慢性感染［1］，而且還能在膀胱上皮細(xì)胞內(nèi)形成生物膜，造成泌尿道持續(xù)感染［2］，具有抵抗力強(qiáng)、耐藥性強(qiáng)等特點(diǎn)［3］。本實(shí)驗(yàn)以大腸埃希菌生物被膜為研究對(duì)象，從生物被膜及大腸埃希菌的生物學(xué)特征出發(fā)，探討中藥有效成分對(duì)大腸埃希菌生物被膜的作用，旨在通過在體外建立E.coli-BF(大腸埃希菌生物被膜模型)，觀察黃連水提物對(duì)E.coli-BF可能的抑制作用，以期為中藥治療大腸埃希菌引起的相關(guān)感染提供依據(jù)。國(guó)內(nèi)關(guān)于生物被膜的研究多是以一次性吸痰管、輸液管、蓋玻片及醫(yī)用硅膠膜為載體，尚未見以Φ30培養(yǎng)皿為載體進(jìn)行研究的相關(guān)報(bào)道，Φ30培養(yǎng)皿體外BF模型的建立，經(jīng)過簡(jiǎn)單的銀染后在顯微攝影系統(tǒng)下即可觀察BF形態(tài)，與以往實(shí)驗(yàn)采用的掃描電鏡法相比，操作簡(jiǎn)單、節(jié)約成本。96孔板體外BF模型的建立，由于結(jié)晶紫染色屬于活細(xì)胞與死細(xì)胞均能被染色，而MTT比色法是活細(xì)胞染色方法，所以MTT法更能準(zhǔn)確反映出藥物對(duì)生物被膜的作用效果，且方法操作簡(jiǎn)便、結(jié)果穩(wěn)定可靠。將2種方法結(jié)合，既能在形態(tài)上觀察生物被膜的形成情況，又能在數(shù)據(jù)上提供科學(xué)依據(jù)，使實(shí)驗(yàn)更具有完整性、創(chuàng)新性、合理性，為以后生物被膜的研究奠定基礎(chǔ)。有些學(xué)者已做了細(xì)菌生物被膜在氣管插管上的形成及抑制作用研究［4-5］，但黃連對(duì)大腸埃希菌生物被膜的作用尚少見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)探討黃連水煎液對(duì)體外大腸埃希菌生物被膜抗菌活性的影響，并確定了最佳給藥時(shí)間及給藥濃度，為進(jìn)一步研究黃連水提物抗菌成分及BF相關(guān)感染的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 大腸埃希菌DH5α由大連波利頓公司提供。

1.1.2 儀器 Φ30培養(yǎng)皿(由上海五一玻璃儀器廠提供);96孔板(美國(guó)costar公司產(chǎn)品);蓋玻片(江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司);6孔板(美國(guó)costar公司產(chǎn)品);NUAIRETM US AUTOFLOW型CO2培養(yǎng)箱(德國(guó) NUAIRE公司);HD2-BCN-1360B型生物潔凈工作臺(tái)(哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司);Milli-Q超純水處理裝置(美國(guó)Millipore公司);OLYMPUS顯微攝影系統(tǒng)(日本OLYMPUSBX51配DP72);SUNBRISE酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司);GHP-9000系列隔水式恒溫箱(上海益恒實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)。

1.1.3 藥物與試劑 黃連水煎液按文獻(xiàn)［6］方法制備，生藥濃度為2 mg/mL，4℃保存，有效使用期為2周;2.5%戊二醛(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20120629);氯化鈣(天津市福晨化學(xué)試劑廠，批號(hào)20090410);硝酸銀(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20090925);硫代硫酸鈉(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20110713);對(duì)苯二酚(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20110609);二甲基亞砜(DMSO)(北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)20120627)，四甲基偶氮唑鹽(MTT)(美國(guó)GIBCO公司);LB培養(yǎng)液(g/L):氯化鈉5，酵母粉5，蛋白胨10，自配;pH 7.4 磷酸鹽緩沖液(g/L):磷酸二氫鉀6.8，氫氧化鈉1.164，自配;生理鹽水:氯化鈉0.09 g/L，自配。

1.2 方法

1.2.1 大腸埃希菌BF模型的建立 參照文獻(xiàn)［7］方法并進(jìn)行改進(jìn)，將大腸埃希菌的單克隆細(xì)菌增殖培養(yǎng)的菌液稀釋20倍，分別置于Φ30培養(yǎng)皿和96孔板中。取2個(gè)經(jīng)過滅菌的Φ30培養(yǎng)皿，一個(gè)培養(yǎng)皿中加入4 mL稀釋菌液，另一個(gè)加入4 mL LB培養(yǎng)液作為空白對(duì)照，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，取出，銀染法觀察大腸埃希菌BF形成過程［8］:生理鹽水充分漂洗去除浮游菌;2.5%戊二醛PBS溶液固定1 h;蒸餾水清洗1 min;飽和氯化鈣溶液結(jié)合15 min;蒸餾水漂洗1 min;5%硝酸銀溶液反應(yīng)15 min;1%對(duì)苯二酚溶液顯色2 min;蒸餾水漂洗1 min;5%硫代硫酸鈉溶液固定2 min;蒸餾水漂洗1 min;光學(xué)顯微鏡20×10倍下觀察是否有大腸埃希菌生物膜在培養(yǎng)皿上的形成情況。96孔板四周為L(zhǎng)B培養(yǎng)基，B～D行每孔加入100 μL稀釋菌液，E～G行每孔加入100 μL LB培養(yǎng)基，作為空白對(duì)照組，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，取出，每孔加人20 μL MTT溶液，重新置于37℃恒溫培養(yǎng)4 h，將菌液吸出，每孔加入150 μL二甲基亞砜溶液，放在微量振蕩器上振搖10 min，在492 nm處掃描，測(cè)定OD值。

1.2.2 影響大腸埃希菌BF生長(zhǎng)的因素 ①菌液濃度:分別將大腸埃希菌的單克隆細(xì)菌增殖培養(yǎng)的菌液稀釋 5、l0、15、20、25、30、35 倍，96 孔板的四周每孔加入100 μL LB培養(yǎng)液，設(shè)置2～8列，每1列為1個(gè)濃度梯度，每孔加入200 μL稀釋菌液，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，MTT法染色后在492 nm處掃描測(cè)定OD值;②培養(yǎng)時(shí)間:取6張96孔板，吸取稀釋20倍的大腸埃希菌的單克隆細(xì)菌增殖培養(yǎng)的菌液加入96孔板，每孔200 μL，四周每孔加入100 μL LB 培養(yǎng)液，考慮到實(shí)驗(yàn)操作時(shí)間的可行性，選定將大腸埃希菌分別培養(yǎng) 6、12、18、24、30、36 h，每張板為一個(gè)時(shí)間梯度，MTT染色后在492 nm處掃描測(cè)定其OD值，考察BF的生長(zhǎng)情況;③不同載體:將大腸埃希菌的單克隆細(xì)菌增殖培養(yǎng)的菌液稀釋20倍分別接種于蓋玻片、6孔板、96孔板、Φ30培養(yǎng)皿，培養(yǎng)24 h，銀染后利用光學(xué)顯微攝影系統(tǒng)觀察BF形態(tài)。

1.2.3 銀染法觀察黃連水煎液作用于BF不同時(shí)間的抑制效果 將大腸埃希菌的單克隆細(xì)菌增殖培養(yǎng)的菌液稀釋20倍，同時(shí)設(shè)置2個(gè)培養(yǎng)組，每組5個(gè)水平，1組為給藥組，1組為空白對(duì)照，向每個(gè)培養(yǎng)皿中加入菌液4 mL，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，空白組加入LB培養(yǎng)液4 mL，給藥組加入黃連水煎液4 mL，重新置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后分別取出1個(gè)空白對(duì)照組和1個(gè)給藥組的培養(yǎng)皿，經(jīng)過銀染法，在光學(xué)顯微攝影系統(tǒng)下觀察。每隔6 h取1次空白對(duì)照組和給藥組經(jīng)過銀染后通過顯微攝影系統(tǒng)觀察黃連水煎液對(duì)大腸埃希菌生物被膜的抑制作用。

1.2.4 不同濃度黃連水提物對(duì) E.coli-BF的抑制作用 在96孔板中建立大腸埃希菌生物被膜體外模型，96孔板的四周加入100 μL的LB培養(yǎng)基，待用。設(shè)置A行為空白對(duì)照組，B～G行每行每5個(gè)孔為1組復(fù)孔，每1組復(fù)孔設(shè)為1個(gè)給藥濃度，共 10個(gè)給藥濃度，分別為 20、40、60、80、100、120、140、160、180、200 mg/mL，置于 37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，MTT法染色，測(cè)其492 nm處的OD值。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 采用 SPSS17.0軟件對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間數(shù)據(jù)比較采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸埃希菌BF模型的建立結(jié)果判斷

2.1.1 Φ30培養(yǎng)皿大腸埃希菌體外模型的建立在顯微攝影系統(tǒng)下觀察發(fā)現(xiàn)加入稀釋菌液的培養(yǎng)皿被濃厚的黑染絮狀膜樣物質(zhì)覆蓋，空白組基本無(wú)黑染絮狀膜樣物質(zhì)，說明Φ30培養(yǎng)皿可以成功構(gòu)建大腸埃希菌體外模型，見圖1。

圖1 Φ30培養(yǎng)皿大腸埃希菌體外模型(200×)Fig.1 Φ30 petri dishes of E.coli-BF in vitro modle(200×)

2.1.2 96孔板大腸埃希菌體外模型的建立通過MTT染色后492 nm處掃描測(cè)定OD值，加入稀釋菌液的模型組的平均OD值為4.191;加入LB培養(yǎng)液的空白組的平均OD值為0.069，此結(jié)果說明96孔板可以成功構(gòu)建大腸埃希菌體外模型。

2.2 影響大腸埃希菌BF生長(zhǎng)的因素結(jié)果判斷

2.2.1 菌液濃度 將大腸埃希菌的單克隆細(xì)菌增殖培養(yǎng)的菌液稀釋5、10、15、20、25、30、35 倍分別培養(yǎng)24 h，稀釋20倍培養(yǎng)液的大腸埃希菌生物膜生長(zhǎng)狀況最佳，且穩(wěn)定，見圖2。

圖2 菌液濃度對(duì)大腸埃希菌BF生長(zhǎng)的影響(200×)Fig.2 Effect of bacterial concentration on E.coli-BF formation(200×)

2.2.2 培養(yǎng)時(shí)間 將大腸埃希菌的單克隆細(xì)菌增殖培養(yǎng)的菌液稀釋 20倍，分別培養(yǎng)6、12、18、24、30、36 h，培養(yǎng)24 h 的大腸埃希菌生物膜生長(zhǎng)最佳并且到36 h一直保持穩(wěn)定，由于實(shí)驗(yàn)時(shí)間的允許性及菌落自我凋亡的代謝周期，選擇24 h為最佳的傳代、鋪板及給藥時(shí)間，見圖3。

圖3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)大腸埃希菌BF生長(zhǎng)的影響(200×)Fig.3 Effect of incubation time on E.coli-BF formation(200×)

2.2.3 不同載體 將大腸埃希菌的單克隆細(xì)菌增殖培養(yǎng)的菌液稀釋20倍，分別接種于蓋玻片、6孔板、96孔板、Φ30培養(yǎng)皿，培養(yǎng)24 h，發(fā)現(xiàn)以上載體均被大腸埃希菌生物被膜覆蓋。載玻片的黑染絮狀膜樣物質(zhì)較稀少;6孔板、96孔板、Φ30培養(yǎng)皿均被濃厚的黑染絮狀膜樣物質(zhì)覆蓋，可以作為通過MTT染色后用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值方法的載體;但由于6孔板、96孔板容易污染顯微鏡頭，所以選擇Φ30培養(yǎng)皿作為通過銀染法利用顯微攝影系統(tǒng)觀察生物膜生長(zhǎng)情況的載體。

2.3 黃連水煎液影響大腸埃希菌 BF光學(xué)顯微攝影系統(tǒng)下的結(jié)果判斷

圖4 不同藥物作用時(shí)間對(duì)大腸埃希菌生物被膜的抑制作用(200×)Fig.4 Effect of differnent treatments on E.coli-BF formation(200 × )

光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果見圖4，A為空白對(duì)照組銀染后光學(xué)顯微鏡照片，整個(gè)視野可見被濃厚的黑染絮狀膜樣物質(zhì)覆蓋，層次多，致密;黑染絮狀膜樣物為BF。B～F為給藥不同時(shí)間銀染后光學(xué)顯微鏡照片，給藥24 h后整個(gè)視野可見散落的黑點(diǎn)或黑斑，無(wú)黑染的絮狀膜樣物，此結(jié)果說明黃連水煎液對(duì)大腸埃希菌作用24 h后即可產(chǎn)生很好的抑制作用，考慮到時(shí)間的問題，選擇24 h作為藥物作用時(shí)間即可。

2.4 不同濃度的黃連水煎液對(duì)大腸埃希菌生物被膜抑制作用的結(jié)果判斷

由圖5可知，當(dāng)藥物濃度達(dá)到80 mg/mL時(shí)開始對(duì)大腸埃希菌生物被膜有抑制作用，抑制率為20.8%(P ＜0.05﹚，藥物濃度為 180 mg/mL時(shí)抑制率達(dá)到70.23%(P＜0.05﹚，藥物濃度高于180 mg/mL抑制率并無(wú)明顯增大，所以選擇180 mg/mL為最佳的給藥濃度。此結(jié)果說明生藥濃度為80 mg/mL的黃連水煎液即可抑制和破壞早期及成熟BF，生藥濃度為180 mg/mL的黃連水煎液對(duì)大腸埃希菌生物膜的抑制作用已很好。

圖5 不同藥物濃度對(duì)大腸埃希菌生物被膜的抑制作用(200×)Fig.5 Effect of different drug concention on E.coli-BF formation(200×)

3 討論

由于生物膜的存在，使得膜內(nèi)的細(xì)菌逃逸抗生素的殺傷作用成為潛在的感染源［9-10］，導(dǎo)致了廣泛耐藥性［11］。藥物的耐藥問題被世界衛(wèi)生組織認(rèn)為是21世紀(jì)最大的健康問題之一，革蘭陰性菌腹膜炎是引起腹透患者死亡和治療失敗的常見原因，大腸埃希菌則是腹透相關(guān)性腹膜炎的最常見的革蘭陰性菌，尋找能夠抑制BF生長(zhǎng)的藥物已成為重要課題。

過去的實(shí)驗(yàn)工作中，有人已經(jīng)成功利用試管法在體外建立大腸埃希菌生物被膜模型［12］。本研究首次提出利用Φ30培養(yǎng)皿構(gòu)建大腸埃希菌生物膜體外模型，通過銀染法在顯微攝影系統(tǒng)下可以很清晰地觀察到大腸埃希菌在LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h即可在培養(yǎng)皿表面形成生物被膜，這一變化形成得很快，進(jìn)一步提示臨床工作中醫(yī)患對(duì)大腸埃希菌相關(guān)性腹膜炎的及時(shí)發(fā)現(xiàn)、及時(shí)處理，對(duì)于改善預(yù)后、預(yù)防復(fù)發(fā)具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)改變以往采用結(jié)晶紫對(duì)微生物的染色方法，采用MTT法，操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、節(jié)約成本。結(jié)晶紫染色法會(huì)使活細(xì)胞和死細(xì)胞均被染色，不能準(zhǔn)確說明藥效，使實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生誤差，而MTT法對(duì)此問題進(jìn)行了改善，比結(jié)晶紫染色更能準(zhǔn)確說明活菌形成BF的能力以及藥物對(duì)BF的影響。

本實(shí)驗(yàn)首次將黃連水煎液運(yùn)用到生物被膜感染的研究，并通過此模型考察了不同作用時(shí)間及不同生藥濃度的黃連水煎液對(duì)BF形成的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃連水煎液對(duì)大腸埃希菌作用24 h后即可產(chǎn)生很好的抑制作用，且隨著藥物濃度的增加，藥物作用效果越明顯，量效呈一定的線性關(guān)系，生藥濃度為180 mg/mL時(shí)達(dá)到最佳，抑制率達(dá)到70.23%。180 mg/mL的黃連水煎液對(duì)大腸埃希菌生物被膜有明顯的抑制和破壞作用，提示其對(duì)大腸埃希菌生物被膜的發(fā)育有明顯的影響，通過研究黃連水煎液對(duì)大腸埃希菌的抑制作用，為進(jìn)一步研發(fā)抵抗大腸埃希菌耐藥菌株的新藥奠定良好基礎(chǔ)。

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