李桂秋，王 穎，陳淑蘭，王少玲，劉 倩，宋熙瑤，路 娟*

(1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，黑龍江 哈爾濱 150001;2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150001)

HBV感染是引起急慢性肝炎的主要病因，每年全世界約有100萬(wàn)人死于HBV相關(guān)性疾病。目前，核苷類似物，如拉米夫定一直用于臨床慢性HBV感染的治療［1］。然而，拉米夫定用于臨床慢抗HBV治療需要很長(zhǎng)的治療周期，從而導(dǎo)致了耐藥株的產(chǎn)生。因此，迫切需要研究出更高效的抗HBV治療方案?；谀孓D(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)在HBV復(fù)制中的重要作用，一些學(xué)者已經(jīng)證實(shí)RNA干擾可以通過(guò)沉默病毒基因來(lái)抑制HBV復(fù)制，這為抗HBV慢性感染提供了一種新的方法。我們?cè)?jīng)報(bào)道過(guò)針對(duì)HBV核定位信號(hào)區(qū)的siRNA能夠有效抑制HBV DNA復(fù)制［2］。因?yàn)镠BV感染是多基因參與的細(xì)胞內(nèi)感染過(guò)程，聯(lián)合使用siRNA能夠發(fā)揮更強(qiáng)的抗HBV作用。本實(shí)驗(yàn)中在HepG2.2.15細(xì)胞中聯(lián)合應(yīng)用siRNA來(lái)抑制HBV復(fù)制，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明聯(lián)合應(yīng)用siRNA比單獨(dú)應(yīng)用siRNA產(chǎn)生更強(qiáng)烈的抑制HBV復(fù)制作用。

1 材料與方法

1.1 材料

Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)，G418購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司，HepG2.2.15細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存，質(zhì)粒 psi/U6由武漢晶賽公司提供，所有PCR引物由上海博雅生物公司合成，Trizol、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、Lipofection 2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，本實(shí)驗(yàn)中所用限制性內(nèi)切酶購(gòu)自NEB公司。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建質(zhì)粒表達(dá)載體 在質(zhì)粒psil/U6的BamHⅠ-HindⅢ位點(diǎn)之間插入一段21 nt的編碼相應(yīng)shRNA的特異序列，構(gòu)建了HBVshRNA的表達(dá)載體，并進(jìn)一步通過(guò)BLAST分析為未發(fā)現(xiàn)同源序列。引物序列如下:siRNA1:5'-AAGATCTCAATCTCGGGAATC-3'; siRNA2: 5'-CAGGTCCCCTAGAAGAAGAAC-3';無(wú)關(guān)對(duì)照質(zhì)粒 HK:5'-ACTACCGTTGTTATAGGTG-3'。重組質(zhì)粒通過(guò)酶切和DNA序列分析加以鑒定。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 HepG 2.2.15細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中 (含青霉素 100 U/mL，鏈霉素 100 μg/mL，G418200 μg/mL)，37℃，體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的孵箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前24 h將細(xì)胞置于6孔板培養(yǎng)，4 μg表達(dá)相應(yīng)siRNA的質(zhì)粒與脂質(zhì)體Lipofectamine 2000按說(shuō)明書(shū)步驟共轉(zhuǎn)染，每24 h更換培養(yǎng)液，分別于48、72、96 h收集細(xì)胞做進(jìn)一步分析，實(shí)驗(yàn)分為5組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.2.3 HBsAg和HBeAg的檢測(cè) 用ELISA方法測(cè)定48、72、96 h細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBsAg和HBeAg的表達(dá)，具體方法按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.4 HBV mRNA的檢測(cè) 分別于48、72、96 h用Trizol法從細(xì)胞中提取RNA，用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。PCR循環(huán)參數(shù)如下:94℃變性3 min;變性94℃ 15 s，退火52℃30 s，延伸72℃ 30 s，循環(huán)30次，最后72℃延伸10 min結(jié)束反應(yīng)。PCR引物如下:HBV上鏈引物:5'-ACCTCTGCCTAATCATCTC-3'，下鏈引物:5'-GTAAGACAGGAAATGTGAAAC-3';β-actin上鏈引物 5'-GTCGGTGTGAACGGATTT-3'，GAPDH下鏈引物5'-ACTCCACGACGTACTCAGC-3'。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖進(jìn)行電泳。

1.2.5 HBV DNA的檢測(cè) 分別于48、72、96 h從細(xì)胞培養(yǎng)上清中提取HBV DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，具體方法按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所得數(shù)據(jù)采用 SPSS 12.0軟件，統(tǒng)計(jì)處理以每組3個(gè)復(fù)孔測(cè)定值的mean±SD表示，組間比較用F檢驗(yàn)和方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 HepG2.2.15細(xì)胞中 HBsAg和 HBeAg的抑制作用

用ELISA方法測(cè)定48、72、96 h細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBeAg和HBsAg的表達(dá)，HBeAg和HBsAg的濃度。如圖1所示，在各個(gè)時(shí)段，無(wú)關(guān)對(duì)照組對(duì)HBsAg和HBeAg的表達(dá)與空載體組相比無(wú)明顯差異 (P＜0.05)，說(shuō)明RNAi作用是特異的。在各個(gè)siRNA治療組，HBsAg和HBeAg水平均有明顯下降，轉(zhuǎn)染96 h后聯(lián)合應(yīng)用siRNA組對(duì)HBsAg和HBeAg的抑制率最強(qiáng) (83.89%、91.07%)與單獨(dú)應(yīng)用siRNA組相比均具有明顯差異 (P＜0.05)。

圖1 siRNA對(duì)HBsAg和HBeAg水平的影響Fig.1 Inhibition of HBsAg and HBeAg expression by siRNA

2.2 HepG2.2.15細(xì)胞中HBV mRNA的抑制作用

HBV mRNA水平用RT-PCR來(lái)檢測(cè)，結(jié)果顯示各個(gè)siRNA治療組均能明顯降低mRNA水平，空載體組對(duì)mRNA無(wú)抑制作用。在96 h聯(lián)合應(yīng)用siRNA組對(duì)mRNA的抑制率最強(qiáng)，幾乎檢測(cè)不到mRNA條帶，抑制效果明顯高于單獨(dú)應(yīng)用組 (圖2)。

圖2 siRNA對(duì)HBV mRNA水平影響Fig.2 Inhibition of mRNA expression by siRNA

2.3 HepG2.2.15細(xì)胞中HBV DNA的抑制作用

HBV DNA水平用實(shí)時(shí)定量PCR來(lái)檢測(cè)，檢測(cè)范圍可以達(dá)到104～108拷貝。如圖3所示，各個(gè)siRNA治療組均能明顯降低DNA水平，空載體組對(duì)DNA無(wú)抑制作用。在96 h，聯(lián)合應(yīng)用siRNA組病毒DNA拷貝數(shù)與對(duì)照組相比減少88.6%，抑制作用明顯高于單獨(dú)應(yīng)用siRNA組(P＜0.05)。轉(zhuǎn)染96 h后，各個(gè)siRNA治療組DNA水平分別下降50.4%(siRNA1)、22.31%(siRNA2)、69.83%(siRNA1+2)。

圖3 siRNA對(duì)HBV DNA水平的影響Fig.3 Reduction of HBV DNA replication by siRNA

3 討論

RNA干擾技術(shù)為治療HBV感染提供了新的有效方法［3］。據(jù)報(bào)道，單獨(dú)應(yīng)用合成的 siRNA治療 HBV、HCV、HIV時(shí)，會(huì)引起病毒突變。為了解決這一問(wèn)題，一種方法是針對(duì)病毒基因組的不同位點(diǎn)設(shè)計(jì)多個(gè)siRNA，另一種方法是選擇相對(duì)保守的區(qū)域。最近有研究表明，聯(lián)合療法可以最大限度降低病毒載量，而成為治療HBV感染的新方法，因此有學(xué)者將核苷類似物或IFN-α等化學(xué)藥物聯(lián)合應(yīng)用以減少病毒含量［4-5］。基于這種方法，本研究在HepG2.2.15細(xì)胞中檢測(cè)了聯(lián)合應(yīng)用siRNA的抗病毒效果，并與單獨(dú)應(yīng)用siRNA進(jìn)行了比較。因?yàn)镠BV感染是多基因參與的細(xì)胞內(nèi)感染過(guò)程，聯(lián)合使用siRNA能夠同時(shí)阻斷病毒基因的多個(gè)位點(diǎn)，使病毒難以修復(fù)，從而發(fā)揮更強(qiáng)的抗HBV作用。

本實(shí)驗(yàn)中，針對(duì)HBV核定位信號(hào)區(qū)的特異性siRNA被轉(zhuǎn)染入HepG2.2.15細(xì)胞中，并對(duì)各種指標(biāo)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。結(jié)果顯示，HBsAg、HBeAg、mRNA水平都受到抑制;同時(shí)，real-time PCR結(jié)果顯示DNA水平也明顯下降，這種抑制作用具有高度選擇性、特異性、劑量依賴性的特點(diǎn)。聯(lián)合應(yīng)用siRNA比單獨(dú)應(yīng)用siRNA產(chǎn)生更強(qiáng)烈的抑制HBV復(fù)制作用。本研究證明聯(lián)合應(yīng)用siRNA的合理性和有效性，為臨床治療HBV感染提供了新的思路。

［1］C.Seeger，W.S.Mason.Hepatitis B virus biology ［J］.Microbiol.Mol.Biol.Rev，2000，(64):51-68.

［2］Li G.Q.，Gu H.x，Li D.，et al.Inhibition of Hepatiis B virus ccc DNA replication by si RNA ［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2007，355:398-404.

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［4］Mohammad Khalid Parvez，Deepak Sehgal，Shiv Kumar Sarin，et al.Inhibition of hepatitis B virus DNA replicative intermediate forms by recombinant interferon-Y ［J］.World Journal of Gastroenterology，2005，12(19):3006-3014.

［5］Z.H .Chen，Z.F.Xu，J.J.Ye，H.P.Yao，et al.Combination of small interfering RNAs mediates greater inhibition of human hepatitis B virus replication and antigen expression ［J］.Journal of Zhejiang University Science，2005，(4):236-241.