張素珍，李思施，韋婷婷，張 凱，關(guān)家偉，吳大暢

(大連醫(yī)科大學(xué)生物技術(shù)系，遼寧 大連 116044)

哺乳動(dòng)物腸道內(nèi)細(xì)菌組成非常復(fù)雜。近年來，腸道菌群對(duì)機(jī)體健康和疾病的影響越來越受到人們的關(guān)注［1-2］，糞便與腸道內(nèi)容物相似，含有大量的微生物、未消化食物和腸道脫落細(xì)胞等［3］，糞便微生物的變化可以間接地反映腸道微生物的變化。糞便分析技術(shù)不同于采血或取組織獲取樣本，屬于非損傷性取樣，應(yīng)用性強(qiáng)［4］。在腸道菌群數(shù)量和種類鑒定過程中，因厭氧菌占多數(shù)，難以利用傳統(tǒng)的選擇培養(yǎng)法進(jìn)行培養(yǎng)，因此無法對(duì)其深入研究［5］。近年來，分子微生態(tài)學(xué)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于腸道菌群多樣性研究中，變性梯度凝膠電泳(DGGE)通過遞增的化學(xué)變性劑濃度梯度把長(zhǎng)度相同堿基組成不同的DNA片段區(qū)分開。該法可有效避免在傳統(tǒng)富集、培養(yǎng)、分離研究過程中造成的微生物多樣性丟失，能夠更直接、可靠地反映出微生物原始組成情況［6］。然而能否獲得高濃度、多樣性程度高、具有代表性的微生物基因組DNA對(duì)后續(xù)的PCR及DGGE分析具有至關(guān)重要的作用。糞便中大量食物殘?jiān)⒔M織脫落物和各種消化道成分的存在，對(duì)微生物DNA的提取造成很大困難。目前糞便微生物細(xì)胞的裂解方法主要有化學(xué)裂解法、物理裂解法、酶解法［7］。不同方法對(duì)微生物細(xì)胞的裂解程度不盡相同，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡牟煌瑢⒁陨戏椒ㄓ袡C(jī)結(jié)合以達(dá)到最佳結(jié)果。本研究在總結(jié)以往報(bào)道的基礎(chǔ)上，對(duì)4種小鼠糞便微生物總DNA提取方法進(jìn)行比較和研究，進(jìn)一步加以改進(jìn)，摸索出適用于小鼠糞便細(xì)菌基因組DNA提取的有效方法，旨在為后續(xù)基于PCR擴(kuò)增及DGGE分析腸道菌群結(jié)構(gòu)提供前提基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)保障。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 SPF、BALB/C小鼠由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，3周齡，體重18～22 g。肛門直接收集糞便樣品于滅菌Ep管中，備用。

1.1.2 主要試劑及儀器 PCR引物由大連寶生物公司合成，Ex Taq DNA聚合酶購自大連寶生物公司，糞便DNA提取試劑盒(市售，中國(guó))。丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺購自美國(guó)Sigma公司，去離子甲酰胺購自上海生物化學(xué)試劑工程公司。DCode變性梯度凝膠電泳系統(tǒng)(大連競(jìng)邁生物科技有限公司)，TDL5M臺(tái)式低速大容量冷凍離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司)、空氣恒溫?fù)u床 KYC-100B、Thermo PCR 循環(huán)儀(PXE 0.2 Thermal Cyder)、PHs-3C精密pH計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，超微量分光光度計(jì)(NanoVue，USA)。

1.2 方法

1.2.1 糞便樣品總DNA的提取 ①基于SDS的裂解法［8-9］(方法Ⅰ):取糞便樣品0.2 g于盛有2 mL PBS的離心管中，混勻，3000 r/min離心10 min，重復(fù)1次。加入1.5 mL的DNA提取液(100 mmol/L Na2EDTA，100 mmol/L 磷酸鈉，100 mmol/L Tris-HCl，1.5 mol/L NaCl，1%CTAB，pH 8.0)和5 μL蛋白酶K(40 mg/mL)于37℃搖床中140 r/min，1 h;加入115 μL 20%SDS，65 ℃水浴2 h(每隔15～20 min輕搖1次)，于室溫4000 r/min離心10 min，取上清。再向沉淀中加入720 μL DNA提取液、2 μL 蛋白酶 K 及 80 μL 20%SDS，漩渦震蕩10 s，65℃水浴10 min，4000 r/min離心10 min，取上清?；旌?次上清液;②市售國(guó)產(chǎn)試劑盒提取DNA(方法Ⅱ):嚴(yán)格按照試劑盒操作說明規(guī)范操作;③改進(jìn)的化學(xué)裂解法 (方法Ⅲ):稱取0.2 g小鼠糞便，加入1 mL PBS，漩渦震蕩，充分混勻后，200×g離心5 min，取上清。重復(fù)1次，混合上述2次上清，300×g離心5 min。將上清轉(zhuǎn)移到新的Ep管中，10000 r/min離心8 min，沉淀菌體。將所得的菌體用1 mL PBS洗滌2～3次(至上清無色)，－20℃保存?zhèn)溆?。向Ep管中加500 μL DNA 提取液(同①)，6 μL 蛋白酶 K(40 mg/mL)37℃、140 r/min搖床振蕩1 h左右，再加入56 μL 20%SDS，65℃水浴2 h(每隔15～20 min輕搖1次);④改進(jìn)的溶菌酶法［10］(方法Ⅳ):同③的方法沉淀菌體。參考改進(jìn)溶菌酶法［10］，稍作改動(dòng)。方法Ⅰ和Ⅲ得到的細(xì)胞裂解液均用等體積的酚/氯仿(Tris-飽和酚∶氯仿∶異戊醇=25∶24∶1)進(jìn)行抽提2～3次，以除蛋白，以0.6倍體積的異丙醇于室溫下沉淀DNA，12000r/min離心10 min，75%乙醇洗滌沉淀，DNA沉淀自然干燥后溶于TE(加RNAse)溶液中并于37℃溫箱中放置30 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.2 16S rDNA V3區(qū)的 PCR擴(kuò)增 以上述DNA提取液為模板擴(kuò)增所有細(xì)菌16S rDNA基因的V3可變區(qū)。根據(jù)文獻(xiàn)［11］設(shè)計(jì)引物及擴(kuò)增體系。PCR反應(yīng)程序:預(yù)變性94℃ 5 min;變性94℃ 30 s，退火54℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán);72℃ 延伸7 min。擴(kuò)增結(jié)果1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.3 PCR反應(yīng)產(chǎn)物的變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析 35% ～55%的變性范圍，60℃恒溫水浴，電壓50～60 V，電泳4 h。電泳完畢后，EB染色30 min，觀察并拍照。利用Gel-Pro analyzer(灰度分析)軟件分析DGGE圖譜。獲得各泳道內(nèi)各條帶的IOD，然后利用Shannon-Weaver index(H’)計(jì)算條帶的多樣性［12］。并采用均勻度Evenness(E)分析菌群分布的統(tǒng)一性。H’和E通過以下公式獲得:

Shannon-Weaver index(H’)=－∑(Pi)(ln Pi);Evenness(E)=H’/InS Pi=ni/N，其中ni為單個(gè)條帶的灰度值，N為所有條帶的灰度值，S為樣品條帶數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種方法提取DNA質(zhì)量的比較

2.1.1 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果 4種方法對(duì)同一糞便進(jìn)行DNA提取的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果見圖1。方法Ⅰ和方法Ⅱ所得DNA提取液在20 kb左右均未見清晰條帶，提示未能成功提取細(xì)菌基因組總DNA。而方法Ⅲ和Ⅳ在目標(biāo)位置可見清晰條帶。圖中泳道1～3、7、8主條帶亮度雖較高，但有少許彌散，說明DNA提取率高但純度不夠，泳道4～6條帶亮度雖不高，但泳道清晰，無彌散。2種方法均成功地提取了細(xì)菌基因組。

圖1 糞便細(xì)菌總DNA提取的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)Fig.1 Agarose gel electrophoresis detection of total DNA from fecal bacteria

2.1.2 方法Ⅲ和Ⅳ 兩種方法所得DNA的純度和濃度比較 OD260nm/OD280nm能夠反映DNA的純度，正常 OD260nm/OD280nm值約為 1.8 ～2.0。若OD260nm/OD280nm值小于1.8或大于2.0說明可能有蛋白質(zhì)或RNA污染［10］，2種DNA提取法獲得DNA的純度和濃度見表1。

表1 DNA純度和濃度檢測(cè)結(jié)果Table 1 Detection of DNA purity and concentration

2.2 細(xì)菌DNA的16S rDNA V3區(qū) PCR擴(kuò)增結(jié)果

由于方法Ⅰ和方法Ⅱ未能成功提取到腸道菌群總DNA，故不能進(jìn)行后續(xù)的PCR擴(kuò)增，所以只對(duì)方法Ⅲ和方法Ⅳ所提取的細(xì)菌總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。由圖2可知，2種方法PCR產(chǎn)物的大小約為230 bp，說明由2種方法提取的DNA均可得到較理想的PCR結(jié)果。

圖2 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.2 Result of PCR amplication

2.3 菌群多樣性DGGE結(jié)果

在從糞便提取細(xì)菌總DNA的過程中不可避免地會(huì)使一些數(shù)量較少的劣勢(shì)菌丟失，造成菌群多樣性降低。DGGE圖譜能夠直觀地反映出菌群多樣性，進(jìn)而判斷DNA提取方法的優(yōu)劣。由圖3分析得出，2種方法均能分離出糞便20余種細(xì)菌。

圖3 DGGE結(jié)果Fig.3 Result of DGGE

利用Gel-Pro analyzer(灰度分析)軟件分析DGGE膠圖及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)所得的豐富度(S)、多樣性(H)及均勻性(E)的結(jié)果見表2。由表2可知，方法Ⅲ和方法Ⅳ的多樣性和均勻性均較好，但方法Ⅳ的豐富度更好。另外利用方法Ⅲ提取DNA的相同樣品之間的差異性較大，較方法Ⅳ的穩(wěn)定性差。

表2 DGGE圖譜多樣性分析結(jié)果Table 2 Diversity analysis of DGGE fingerprinting

3 討論

糞便中含有較多雜質(zhì)，在糞便微生物DNA提取過程中，未消化的食物殘?jiān)ひ?、消化酶等雜質(zhì)可能會(huì)導(dǎo)致DNA降解或后續(xù)PCR反應(yīng)抑制物的產(chǎn)生。因此，在動(dòng)物糞便微生物總DNA提取時(shí)，保證DNA的純度和濃度是提取技術(shù)的關(guān)鍵。目前，各種提取糞便細(xì)菌總DNA的方法均是圍繞如何去除這些雜質(zhì)和抑制物進(jìn)而得到高純度且足夠量的目的基因而展開［13］。在化學(xué)裂解法裂解微生物細(xì)胞過程中，通常包括能夠攻擊細(xì)菌細(xì)胞壁和除去細(xì)胞膜的2種成分，從而暴露DNA。溶菌酶和乙二胺四乙酸鹽(EDTA)通常用于削弱細(xì)胞壁的作用，去垢劑如十二烷基硫酸鈉(SDS)來破壞細(xì)胞膜，協(xié)助整個(gè)細(xì)胞外壁的裂解過程［14］。另外陽離子表面活性劑十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)主要功能是分解多糖，破壞細(xì)胞壁完整性。在DNA提取中常用的蛋白酶K能夠降解蛋白，使DNA充分游離。

本實(shí)驗(yàn)采用基于SDS的裂解法(Ⅰ)、國(guó)產(chǎn)市售試劑盒(Ⅱ)、改進(jìn)的化學(xué)裂解法(Ⅲ)和改進(jìn)的溶菌酶法(Ⅳ)四種方法分別對(duì)小鼠糞便細(xì)菌總DNA進(jìn)行了提取，其中方法Ⅲ是在方法Ⅰ的基礎(chǔ)上改進(jìn)而來。方法Ⅰ和方法Ⅱ是直接在糞便中加入細(xì)胞裂解液，而方法Ⅲ和方法Ⅳ則是先將微生物從糞便雜質(zhì)中分離除雜后再裂解微生物細(xì)胞。從DNA提取結(jié)果可以看到，先分離后裂解的效果優(yōu)于直接裂解細(xì)胞。本研究還發(fā)現(xiàn)，分離除雜后的微生物細(xì)胞經(jīng)過反復(fù)凍融后再進(jìn)行裂解的DNA提取效果較分離除雜后直接裂解效果好。在方法Ⅰ和方法Ⅲ中:通過EDTA、CTAB及蛋白酶K的配合使用，達(dá)到破碎微生物細(xì)胞，獲取游離DNA的目的。方法Ⅳ則利用溶菌酶破壞細(xì)胞壁。從DNA提取的濃度和純度上看，方法Ⅲ提取的DNA純度高于方法Ⅳ，但DNA的濃度卻低于方法Ⅳ。OD260nm/OD280nm顯示方法Ⅲ所得DNA提取液中含有一定量的RNA雜質(zhì)，而方法Ⅳ則含有蛋白質(zhì)污染。但2種方法得到的總DNA均能成功地進(jìn)行后續(xù)PCR擴(kuò)增，且變性梯度凝膠電泳圖譜中清晰地分出了20多種不同的條帶。除多樣性和均勻性相似外，方法Ⅳ的豐富度和穩(wěn)定性更佳。

目前多數(shù)實(shí)驗(yàn)室采用市售試劑盒提取糞便菌DNA，效果雖好但價(jià)格昂貴，而常規(guī)的傳統(tǒng)DNA提取方法步驟多、耗時(shí)長(zhǎng)，且提取質(zhì)量不佳，二者均不適合基層實(shí)驗(yàn)室大批量分析使用，故如何利用分子生物學(xué)常規(guī)試劑建立糞便細(xì)菌總DNA提取的穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)、快捷的方法，并能夠適用于下游PCR-DGGE分析具有重要的實(shí)踐和經(jīng)濟(jì)意義。本研究中的方法Ⅲ和Ⅳ利用實(shí)驗(yàn)室常規(guī)試劑完成了對(duì)腸道菌群總DNA的較高質(zhì)量的提取，成本低且重復(fù)性好，具有較強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值，為研究腸道菌群的結(jié)構(gòu)提供了基礎(chǔ)，值得實(shí)驗(yàn)室深入推廣。

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