楊 瑞，王 斌，錢冬萌，李 玲，周 雯，王桐梅，胡 明，陳 豪，宋旭霞

(青島大學醫(yī)學院病原生物學教研室，山東 青島 266071)

巨細胞病毒(cytomegalovirus，CMV)屬于β皰疹病毒亞科，為線性雙鏈DNA病毒，其基因組長度超過230 kb［1］，能夠使人類致病的CMV為人巨細胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)。我國是世界上HCMV先天性感染發(fā)病較高的國家之一，在普通人群中的感染率為80%以上，某些特殊地區(qū)和人群中感染率可達100%。在孕婦和免疫能力低下者(如器官移植病人、艾滋病患者)，該病毒可引發(fā)極為嚴重的并發(fā)癥［2］。HCMV也能夠通過母嬰傳播，是人類重要的致畸、致神經損傷病原體［3］。HCMV對宿主和組織培養(yǎng)均具有嚴格的種屬特異性，且機制尚不清楚。一般僅感染其自身宿主或同屬動物，也只有用其自身宿主的成纖維細胞才可進行體外培養(yǎng)，并產生高滴度的感染性子代病毒顆粒。雖然目前已有利用人源化小鼠成功建立HCMV感染與疾病的動物模型［4-5］，但其昂貴的費用等卻為科研帶來太多困難。HCMV感染容許細胞可分為吸附與穿入、病毒基因的表達、病毒DNA的復制以及病毒的組裝與釋放。HCMV感染宿主細胞后，其基因表達和調控呈現(xiàn)嚴格的時序性，依次表達即刻早期基因(immediate-early，IE)、早期基因 e(early，E)和晚期(late，L)基因。Sandford等［6］發(fā)現(xiàn)即使把 HCMV IE基因的增強子換成MCMV的增強子也并不能改變其宿主趨向性，由此證明HCMV的宿主特異性并不取決于即刻早期階段。本研究用人和小鼠新鮮胚胎組織分離培養(yǎng)原代成纖維細胞，觀察2種細胞體外感染HCMV AD169后的形態(tài)學改變，檢測各期病毒基因和蛋白表達情況等，為進一步研究和探討HCMV可能的種屬特異性機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料主要試劑與儀器

胎齡為8～10周的自愿米菲司酮流產的新鮮胎兒，經其父母知情同意，由青島市海慈醫(yī)院提供;6～8周昆明小鼠購自青島市藥品檢驗所;DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清為Hyclone公司產品;RNAiso Plus購自TaKaRa公司;AMV Reverse Transcription System Kit、PCR Mix 購自 Fermentas公司;Triton X-100購自Sigma公司;RIPA細胞裂解液、PMSF購自Solarbio公司;ECL發(fā)光顯色試劑盒購自Boster公司;5×蛋白上樣緩沖液;彩色預染蛋白分子量標準(10～170 ku)購自碧云天生物技術研究所(Catalog No.P0068);封閉用正常山羊血清，鼠抗 IE1、IE2、UL84、UL83，Cy3 標記的羊抗鼠IgG購自北京博奧森生物公司;倒置熒光顯微鏡為日本Olympus公司產品;白光凝膠成像系統(tǒng)為法國Vilber Lourmat產品。

1.2 方法

1.2.1 原代細胞分離與培養(yǎng) 人胚胎用75%乙醇消毒10 min后，無菌器械解剖取肺，將其剪成直徑小于0.5 mm的碎塊，行組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)。將6～8周齡昆明小鼠雌雄比例為2∶1合籠，次日早晨檢查雌鼠，出現(xiàn)陰栓者記為0.5 d。選擇孕期12.5～14.5 d的雌鼠脫臼處死，75%酒精消毒后，用無菌器械取出小鼠胚胎，用PBS清洗3～5遍，去除頭部、四肢和內臟，剩余軀干部分剪成小于0.5 mm的碎塊，行組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)。原代人胚胎成纖維細胞(HEF)和小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)在含有10%胎牛血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)基中呈貼壁生長，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待其長滿瓶底90%以上常規(guī)消化、傳代，取3代以內生長良好、對數(shù)生長期的細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.2 HCMV病毒增殖和滴度測定 取出凍存的HCMV AD169毒株(法國巴斯德研究所惠贈)，在流動的自來水中迅速融化，將對數(shù)生長期的HEF更換無血清培養(yǎng)基，加入100 μL病毒懸液，于37℃、5%的恒溫箱中培養(yǎng)2 h，期間每隔15 min輕輕晃動培養(yǎng)瓶1次。棄掉培養(yǎng)液后，加入含有2%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基維持培養(yǎng)，隨時觀察并記錄細胞的變化，待細胞病變至80%以上時用細胞刮刀刮取細胞并收集培養(yǎng)液上清，－86℃反復凍融3次，使病毒顆粒釋放，1500 r/min離心10 min，收集上清液作為病毒儲存液，分裝至EP管并保存于－86℃冰箱。通過空斑定量法，確定本實驗所用病毒滴度為2×106PFU/mL。

1.2.3 HCMV特征性病變效應(CPE)的觀察將3代以內且對數(shù)生長期的HEF和MEF接種于25 m2培養(yǎng)瓶中(1×106個/mL)，常規(guī)培養(yǎng)24 h，換用無血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，加入制備好的HCMV AD169毒株100 μL(MOI=5)繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，棄去培養(yǎng)液，分別加入2%FBS的 DMEM/F12培養(yǎng)基維持培養(yǎng)，同時設立陰性對照(未感染病毒的正常細胞)，在相差顯微鏡下逐日觀察細胞形態(tài)學變化。另外，將HCMV感染MEF 3 d后的培養(yǎng)物上清反復凍融3次，離心后收取培養(yǎng)物上清，分別將 1 μL、10 μL、100 μL、1 mL、10 mL 的上清液加入生長狀態(tài)良好的HEF，換用無血清的DMEM/F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 h后棄去培養(yǎng)液，分別加入2%FBS的 DMEM/F12培養(yǎng)基維持培養(yǎng)，同時設立陰性對照(未感染病毒的正常細胞)，相差顯微鏡下逐日觀察細胞形態(tài)學變化。

1.2.4 RT-PCR 檢測 HCMV 感染2 種細胞6、24、48 h時IE1、IE2、UL84、UL83 mRNA的表達 取對數(shù)生長期的HEF和MEF接種細胞培養(yǎng)皿(密度約105/mL)，培養(yǎng)過夜后加入 HCMV AD169(MOI=5)，分別在病毒感染后6、24、48 h收集細胞。按照RNAiso Plus說明書提取細胞總RNA，紫外分光光度計測定其純度和濃度，并在DNase處理后進行反轉錄，PCR擴增IE1、IE2、UL84、UL83基因，各基因的PCR引物序列見表1。PCR擴增條件:94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s共30個循環(huán)，72℃延伸10 min。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物后UVP凝膠成像系統(tǒng)拍照。Quantity One軟件進行灰度分析，將目的基因條帶與內參人β-actin和鼠GADPH基因條帶的灰度值的比值來作為目標基因的相對表達量，實驗重復3次。

表1 RT-PCR引物序列表Table 1 Sequence of primers used for RT-PCR

1.2.5 Western-blot檢測HCMV AD169 感染2 種細胞24、48、72 h 時 IE1、IE2、UL84、PP65 蛋白的表達 取對數(shù)生長期的HEF和MEF接種細胞培養(yǎng)皿(密度約105/mL)，用RIPA細胞裂解液400 μL、PMSF 4 μL提取未經病毒感染的細胞和HCMV AD169感染24、48、72 h的總蛋白，以BCA 蛋白濃度測定試劑盒進行蛋白定量，取等量樣品進行SDS-PAGE電泳，電泳至分離膠底部后，電轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫搖床封閉2 h，TBST洗膜 3次，每次 10 min;鼠抗 IE1、IE2、UL84、PP65(UL83編碼產物)蛋白單克隆抗體 (1∶1000)4℃孵育過夜，TBST洗膜3次后加入HRP標記的羊抗鼠和羊抗兔IgG，室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，Vilber Lourmat凝膠成像系統(tǒng)顯色。分析計算目的蛋白與內參Actin蛋白灰度之比，以此表示目的蛋白的相對表達量。實驗重復3次。

1.2.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。所得數(shù)據(jù)以表示。對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

1.2.7 細胞爬片與免疫熒光 取對數(shù)生長期的HEF和MEF接種到含已包被玻片的24孔板內(密度約105/mL)，培養(yǎng)24 h后換成2%DMEM/F12培養(yǎng)液，4 h后加入HCMV，培養(yǎng)72 h后多聚甲醛固定細胞，0.1%Triton X-100室溫透化30 min，10%山羊血清室溫封閉30 min，過夜孵育小鼠抗 HCMV IE、PP65、β-actin蛋白單克隆抗體，PBS充分洗滌后，與FITC標記的山羊抗小鼠IgG和Cy3標記的山羊抗兔IgG 37℃孵育2 h，hoechst室溫染核10 min，75%甘油封片后在激光共聚焦顯微鏡下觀察、拍照。

2 結果與分析

2.1 HCMV AD169感染HEF和MEF形態(tài)學觀察

原代培養(yǎng)24 h即可見HEF和MEF呈放射狀從組織塊中遷移出來，貼壁生長。72 h即可棄去組織塊并進行傳代培養(yǎng)。初次培養(yǎng)的細胞會夾雜一些非成纖維細胞，可利用差速貼壁法純化得到高純度的細胞系。細胞形態(tài)為典型纖維形或梭形，細胞輪廓清晰，折光度良好。

取3代以內生長良好、對數(shù)生長期的HEF和MEF用于感染HCMV AD169(MOI=5)，此過程用含2%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基維持培養(yǎng)。3 d后HEF細胞出現(xiàn)HCMV特征性巢狀病變效應(CPE)，巢內細胞變大變圓，而周圍細胞仍為成纖維形;6 d左右，超過80%的HEF細胞出現(xiàn)典型的CPE，細胞變圓，部分細胞融合為多核巨細胞，呈典型的巨細胞病毒感染后的細胞形態(tài)學改變。而MEF感染組則未發(fā)生明顯的CPE，而是出現(xiàn)大規(guī)模的細胞死亡現(xiàn)象，細胞狀態(tài)愈來愈差，有老化現(xiàn)象(見圖1)。

另外，將HCMV AD169感染MEF 3 d后的培養(yǎng)物上清反復凍融3次，離心后取上清，設置濃度梯度再分別感染HEF，相差顯微鏡下逐日觀察均未出現(xiàn)明顯的HCMV特征性CPE。

圖1 HCMV AD169感染后HEF和MEF的形態(tài)學變化(MOI=5)(400×)Fig.1 The morphological changes of HEF and MEF which were infected with HCMVAD169(MOI=5)by phase contrast microscope(400 ×)

2.2 RT-PCR檢測HCMV AD169感染HEF和MEF 后 IE1、IE2、UL84、UL83基因的表達

HCMV AD169(MOI=5)感染 HEF 6、24、48 h，IE1、IE2、UL84、UL83 mRNA 表達明顯高于未感染組(P ﹤0.01);而MEF 在6、24、48 h 僅IE1、IE2表達顯著高于未感染組(如圖2)，且IE2在HEF組中的相對表達量顯著高于MEF組(P﹤0.05)。延長感染時間再行檢測，也未見任何變化。HEF和 MEF組中 IE1、IE2、UL84、UL83 mRNA相對表達量見表2。

2.3 Western-blot檢測 HCMV AD169 感染HEF和MEF后IE、E、L蛋白的表達

HEF感染HCMVAD169后24 h檢測到IE1蛋白表達，48 h表達 IE2、UL84蛋白，72 h表達PP65(UL83編碼產物)蛋白(如圖3)，其相對表達量均顯著高于未感染組(P﹤0.01)。而MEF感染HCMV AD169后僅在24 h顯著表達IE1和IE2蛋白(P﹤0.01)，不表達 UL84和 PP65蛋白。且IE1、IE2在HEF組中的相對表達量顯著高于 MEF組(P﹤ 0.05)。HEF和 MEF組中IE1、IE2、UL84和PP65蛋白相對表達量見表3。

圖2 PT-PCR檢測HEF和MEF組IE1、IE2、UL84、UL83 mRNA 的表達Fig.2 Expressions of IE1、IE2、UL84、UL83 mRNA in HEF and MEF cells infected with HCMV by RT-PCR

表2 HEF和MEF組中IE1、IE2、UL84和UL83 mRNA相對表達量比較()Table 2 The relative value of IE1，IE2，UL84 and UL83 mRNA in HEF and MEF groups

表2 HEF和MEF組中IE1、IE2、UL84和UL83 mRNA相對表達量比較()Table 2 The relative value of IE1，IE2，UL84 and UL83 mRNA in HEF and MEF groups

注:與HEF和MEF組的0 h比較*P﹤0.01，與HEF組相應時間點比較▲P﹤0.05，下表同。

組別IE1 IE2 UL84 UL83 HEF 組0 h 0 0 0 06 h 0.87 ±0.07*0.71 ±0.11*0.77 ±0.28*1.38 ±0.37*24 h 0.92 ±0.22*1.11 ±0.09*0.94 ±0.49*1.87 ±0.09*48 h 0.98 ±0.18*1.29 ±0.32*1.05 ±0.43*2.01 ±0.61*MEF組0 h 0 0 0 06 h 0.57 ±0.12＊▲ 0.31 ±0.05＊▲ 0.09 ±0.02 0.05 ±0.0224 h 0.61 ±0.06＊▲ 0.29 ±0.03＊▲ 0.10 ±0.04 048 h 0.63 ±0.13＊▲0.37 ±0.02 ＊▲00

圖3 Western-blot檢測HEF和MEF 組 IE1、IE2、UL84和PP65蛋白的表達Fig.3 Expressions of IE1、IE2、UL84 and PP65 in HEF and MEF by Western-blot

表3 HEF和MEF組中IE1、IE2、UL84和PP65蛋白相對表達量比較()Table 3 The relative value of IE1、IE2、UL84 Group and PP65 in HEF and MEF groups

表3 HEF和MEF組中IE1、IE2、UL84和PP65蛋白相對表達量比較()Table 3 The relative value of IE1、IE2、UL84 Group and PP65 in HEF and MEF groups

組別IE1 IE2 UL84 PP65 HEF 組0 h 0 0 0 024 h 0.83 ±0.12*0.53 ±0.08* 0 048 h 0.79 ±0.06*0.57 ±0.17*0.83 ±0.09*0.51 ±0.19*72 h 0.67 ±0.03*0.61 ±0.07*0.95 ±0.17*0.59 ±0.24*MEF組0 h 0 0 0 024 h 0.33 ±0.23＊▲ 0.27 ±0.08＊▲ 0 048 h 0.41 ±0.09＊▲ 0.26 ±0.13＊▲ 0 072 h 0.38 ±0.17＊▲ 0.21 ±0.21＊▲00

圖4 免疫熒光檢測HEF和MEF感染HCMV AD16972 h后IE和PP65蛋白的表達Fig.4 Expressions of IE and PP65 protein in HEF and MEF by immunofluorescence assay

2.3 免疫熒光檢測HCMV AD169感染HEF和MEF后IE和PP65蛋白的表達

HCMV AD169(MOI=5)感染HEF 72 h明顯表達IE和PP65蛋白，而MEF內未見明顯的IE和PP65蛋白(見圖4)。

3 討論

HCMV具有嚴格的種屬特異性和細胞嗜性，在人以外的動物組織和細胞上難以建立復制并產生完整的子代病毒顆粒，長期以來國內外對CMV致病性的研究主要是以MCMV感染鼠為模型進行研究。但是近年來，國內學者相繼有文章報道成功建立HCMV感染野生型小鼠的動物模型。本實驗室選取長期連續(xù)傳代擴增的HCMV AD169毒株和從昆明小鼠胚胎成功分離培養(yǎng)的成纖維細胞，將相同毒株以相同的MOI值(MOI=5)感染HEF(陽性對照組)和MEF(實驗組)，光學相差顯微鏡觀察細胞感染后的形態(tài)學變化，發(fā)現(xiàn)并未出現(xiàn)明顯的HCMV特征性CPE。另外，將HCMV感染MEF 72 h后的培養(yǎng)物上清反復凍融3次，離心后的上清設置濃度梯度分別感染HEF，亦未出現(xiàn)明顯的CPE，不符合柯赫法則對于微生物感染的要求。本實驗為盡可能模擬真實的HCMV感染允納細胞和非允納細胞的體內環(huán)境，用新鮮的人和小鼠胚胎組織中分離培養(yǎng)出原代HEF和MEF，以HCMV AD169株感染HEF為陽性對照，RT-PCR結果顯示在感染病毒的MEF細胞內，僅HCMV IE1和IE2即刻早期基因表達量顯著高于未感染HCMV組(P﹤0.01);Westernblot結果顯示只有IE1和IE2蛋白表達量顯著高于未感染組(P﹤0.01);免疫熒光檢測未發(fā)現(xiàn)明顯的IE和PP65蛋白的表達。以上結果均表明，本實驗室儲存HCMV AD169株不能體外跨種屬感染原代培養(yǎng)的小鼠胚胎成纖維細胞，未能成功建立HCMV AD169株體外感染小鼠成纖維細胞的動物模型，且HCMV基因產物在原代MEF細胞中的表達阻止在IE蛋白表達與l基因表達之間。

作為人類皰疹病毒組中最大的病毒，HCMV感染宿主細胞后，其基因表達和調控呈現(xiàn)嚴格的時序性，依次表達即刻早期基因IE1和IE2，早期基因E和晚期基因L。其中IE基因主要編碼一些免疫調節(jié)因子，其表達是由宿主細胞因子所激活，并不依賴任何新的蛋白的合成［7］。IE蛋白為E基因的表達提供必要的條件［8］。雖然IE基因在宿主細胞中的存在有重要意義，但它的表達并不等同于完整病毒顆粒的復制。Ellsmore等［9］證實HCMV能夠有效吸附并穿入多種細胞包括一些非容許細胞系如人胚腎293細胞和Vero細胞，并在HCMV穿入細胞后檢測到了IE1的表達。Lafemina等［10］證實 BALB/c-3T3 細胞可以表達HCMV或SCMV的IE1和IE2，但都不能產生完整病毒顆粒。UL84是一種HCMV早期蛋白，也是重要的功能蛋白，主要合成HCMV DNA復制因子，為HCMV DNA復制所必須。UL84是目前為止發(fā)現(xiàn)的唯一與IE2蛋白相互作用的病毒蛋白，Sanders RL等［11］研究發(fā)現(xiàn)IE2蛋白的相對表達量的降低能夠導致 UL84蛋白丟失。PP65為UL83基因所編碼的 HCMV晚期蛋白之一，是HCMV的標志性結構蛋白。已有研究證實，在潛伏感染狀態(tài)下，IE基因持續(xù)、低水平的升高不能有效激活E、L基因，但在IE基因拷貝數(shù)明顯增多的細胞內卻相繼發(fā)現(xiàn)高效表達的P52蛋白和MCP mRNA［12］。本研究結果顯示，雖然 HCMV 即刻早期基因和其蛋白產物可以在MEF內持續(xù)表達，但表達水平顯著低于 HEF感染組(P﹤0.05)，相反在IE基因明顯高表達的允許細胞HEF內也相繼高表達UL84和UL83基因和相應的蛋白。此結果提示在HCMV跨種屬感染過程中，可能有一種機制從一開始就在某種程度上阻止了病毒基因的表達和蛋白的翻譯，導致即刻早期基因和蛋白的表達減少。而少量的即刻早期蛋白又不足以啟動早期和晚期基因的表達程序，故導致早期蛋白不能表達，進而病毒DNA復制階段受阻，最終無法合成完整的子代病毒顆粒。因此認為感染細胞MEF內低水平的IE相對表達量可能是無法啟動基因組表達的主要原因，也是HCMV種屬特異性分子機制形成的原因之一。

綜上所述，不完整的HCMV基因時序表達是HCMV種屬特異性形成的基礎，IE基因的低水平表達導致下游基因的表達無法正常啟動可能是其中的關鍵因素。因此，尋找抑制IE基因表達的主要原因，是克服HCMV種屬特異性，建立HCMV感染的動物模型的捷徑之一。

［1］Montague M G，Hutchison C R.Gene content phylogeny of herpesviruses［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2000，97(10):5334-5339.

［2］Pass R F，Burke R L.Development of cytomegalovirus vaccines:prospects for prevention of congenital CMV infection［J］.Semin Pediatr Infect Dis，2002，13(3):196-204.

［3］Schleiss M R.Congenital cytomegalovirus infection:update on management strategies［J］.Curr Treat Options Neurol，2008，10(3):186-192.

［4］Maidji E，Kosikova G，Joshi P，et al.Impaired surfactant production by alveolar epithelial cells in a SCID-hu lung mouse model of congenital human cytomegalovirus infection［J］.J Virol，2012，86(23):12795-12805.

［5］Smith M S，Goldman D C，Bailey A S，et al.Granulocyte-colony stimulating factor reactivates human cytomegalovirus in a latently infected humanized mouse model［J］.Cell Host Microbe，2010，8(3):284-291.

［6］Sandford G R，Brock L E，Voigt S，et al.Rat cytomegalovirus major immediate-early enhancer switching results in altered growth characteristics［J］.J Virol，2001，75(11):5076-5083.

［7］Ahn K，Angulo A，Ghazal P，et al.Human cytomegalovirus inhibits antigen presentation by a sequential multistep process［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences，1996，93(20):10990-10995.

［8］DeMarchi J M，Schmidt C A，Kaplan A S.Patterns of transcription of human cytomegalovirus in permissively infected cells［J］.J Virol，1980，35(2):277-286.

［9］Ellsmore V，Reid G G，Stow N D.Detection of human cytomegalovirus DNA replication in non-permissive Vero and 293 cells［J］.J Gen Virol，2003，84(Pt 3):639-645.

［10］Lafemina R L，Hayward G S.Differences in cell-type-specific blocks to immediate early gene expression and DNA replication of human，simian and murine cytomegalovirus［J］.J Gen Virol，1988，69(Pt 2):355-374.

［11］Sanders R L，Spector D H.Human cytomegalovirus IE286 and IE240 proteins differentially regulate UL84 protein expression posttranscriptionally in the absence of other viral gene products［J］.J Virol，2010，84(10):5158-5170.

［12］趙楊，陳敦金，聞良珍.人巨細胞病毒基因時序表達對感染結局的影響［J］.中華微生物學和免疫學雜志，2004，24(10):834-838.