陳 艷，姚 宏，林新華

1福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物化學(xué)系;2福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物分析系，福州 350004

苜蓿素(Tricin，4'，5，7-三羥基-3'，5'-二甲氧基黃酮)是天然黃酮的一種，廣泛存在于中草藥中，也存在小麥、大麥、米等谷類食物中［1］。有報(bào)道，苜蓿素可抑制結(jié)腸癌SW480細(xì)胞、HT29細(xì)胞菌落的形成［2］;也可抑制人 MDA-MB-468乳腺癌細(xì)胞，阻滯細(xì)胞周期于G2/M，但未誘導(dǎo)凋亡［3］;通過(guò)抑制COX酶和PGE2，從而降低了ApcMin鼠腺瘤的發(fā)生［4］。苜蓿素對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞的作用機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道，本研究觀察苜蓿素對(duì)人結(jié)腸癌SW1116細(xì)胞增殖和凋亡的作用，并探討其作用機(jī)制。

1 材料

電泳儀(美國(guó)EC公司)、熒光顯微鏡IX70(O-lympus)、流式細(xì)胞儀(BD FACSCalibur)、Gel DOC 2000凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)伯樂(lè)公司)、DYCP-31C型電泳槽(北京六一儀器廠)和Microplate Reader 450酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。人直腸癌SW1116細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所，細(xì)胞培養(yǎng)于含10%小牛血清的1640培養(yǎng)液中，在37℃，飽和濕度及5%CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)時(shí)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞;苜蓿素為本實(shí)驗(yàn)室從蒲葵子中提取分離得到(經(jīng)HPLC測(cè)定，面積歸一化法檢測(cè)，苜蓿素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 99.0%)［13］。RPMI-1640(Gibico公司)，小牛血清、DMSO、MTT均購(gòu)自Amresco公司，DNA Mark、DNA Ladder抽提試劑盒(離心柱式)購(gòu)自碧云天試劑有限公司，細(xì)胞凋亡試劑盒為南京凱基，BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)，ECL增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光底物檢測(cè)試劑盒為北京中杉。吖啶橙(AO，F(xiàn)luka公司)，溴化乙錠(EB，華美公司)，碘化丙啶(PI，Sigma公司);其余試劑均為分析純產(chǎn)品。

2 方法

2.1 MTT法檢測(cè)苜蓿素對(duì)SW1116細(xì)胞生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW1116細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔接種180 μL，細(xì)胞接種密度為2×104/mL，在37°C，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。之后，藥物組加入等體積不同濃度的藥物20 μL/孔，使其終濃度分別為 100，20，4，0.8，0.16 μg/mL;每組濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。在5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，每孔加入MTT溶液(5 mg/mL)20 μL，繼續(xù)孵育4 h 后，棄凈上清液，每孔加入150 μL DMSO，37 °C 振蕩10 min，使其充分溶解。酶聯(lián)檢測(cè)儀492 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A)值。計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，抑制率(IR%)=［(A對(duì)照-A實(shí)驗(yàn))/(A對(duì)照-A空白)］×100%;以不同濃度的苜蓿素為橫座標(biāo)，以抑制率為縱坐標(biāo)，繪制苜蓿素對(duì)SW1116細(xì)胞增殖抑制的影響曲線，并計(jì)算半數(shù)抑制濃度IC50值。

2.2 熒光顯微鏡觀察苜蓿素對(duì)SW1116細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SW1116細(xì)胞，全培養(yǎng)液稀釋成4×104/mL接種于96孔培養(yǎng)板，加入不同濃度的苜蓿素，使終濃度分別為20，4 μg/mL;設(shè)立對(duì)照組(加入等體積溶劑的培養(yǎng)液)，孵育72 h，加入10 μL丫啶橙AO和溴化乙錠EB混合液，立即置熒光顯微鏡觀察并拍照(激發(fā)波長(zhǎng)490 nm)。

2.3 流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)細(xì)胞周期分布

收集 60，20，2 μg/mL 苜蓿素作用 72 h 的SW1116細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞，加入70%冷乙醇固定過(guò)夜，離心去除乙醇，PBS洗滌細(xì)胞，加入RNase(0.5 mg/管)，輕輕懸浮細(xì)胞，37 °C 孵育30 min。4 °C避光PI染色30 min，用300目濾網(wǎng)過(guò)濾，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布和凋亡。

2.4 瓊脂糖凝膠電泳分析DNA Ladder測(cè)定

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW1116細(xì)胞，以含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋并接種于6孔板上，使成5×104個(gè)/孔，37°C 、5%CO2條件下孵育24 h后，加藥，使苜蓿素的終濃度為 100，20，4 μg/mL，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。收集細(xì)胞，按照DNA Ladder試劑盒說(shuō)明書方法進(jìn)行 DNA提取。DNA上樣5 μL，1.5% 瓊脂糖凝膠電泳，2 V/cm，電泳分析，將凝膠浸入EB中染色30 min，采用凝膠成像分析儀觀察并照像［5］。

2.5 Western Blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)

根據(jù)待測(cè)蛋白要求制膠，上樣(100 μg/孔)，電泳，電轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜，取下膜用Fast Green Solution預(yù)染，洗10 min，標(biāo)記Marker，裁剪膜，5%(w/v)脫脂奶粉室溫封閉30 min，TBST洗10 min，加一抗4°C孵育過(guò)夜，TBST洗5×3 min，加二抗室溫輕搖40 min，TBST洗5×3 min，發(fā)光試劑盒顯色1 min，放入暗盒，固定，拍片，標(biāo)記分析存檔。所有結(jié)果采用β-Tubulin為內(nèi)參，用Densitometry(Molecular Dynamics)灰度掃描軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行半定量分析。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 苜蓿素對(duì)SW1116細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用

人結(jié)腸癌細(xì)胞SW1116對(duì)苜蓿素敏感，藥物作用72h后，隨著苜蓿素藥物濃度的升高，細(xì)胞抑制率升高，呈劑量依賴性(見(jiàn)圖1)，其中得出IC50值的苜蓿素作用濃度為8.11 μg/mL。

圖1 不同濃度苜蓿素作用72 h對(duì)細(xì)胞抑制率的影響Fig.1 Inhibition rate of SW1116 cells after treated by tricin with different concentration for 72 h

3.2 苜蓿素對(duì)SW1116細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)的影響

通過(guò)熒光顯微鏡觀察，AO/EB染色后，對(duì)照組細(xì)胞全部被染成綠色，細(xì)胞壁完整(見(jiàn)圖2A)。苜蓿素(4 μg/mL)組SW1116細(xì)胞，出現(xiàn)大量的核染色質(zhì)呈固縮狀或圓珠狀(見(jiàn)圖2B);苜蓿素(20 μg/mL)作用72 h后，可見(jiàn)明顯的粒狀熒光體聚集，即凋亡小體，同時(shí)可見(jiàn)大量細(xì)胞裂解、壞死，發(fā)出紅色熒光(見(jiàn)圖2C)。

圖2 不同濃度的苜蓿素對(duì)SW1116細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)的影響(AO/EB染色，×400)Fig.2 Morphological alterations of SW1116 cells which were treated by tricin with different concentrations(AO/EB staining，×400)

3.3 苜蓿素對(duì)SW1116細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞周期分布的檢測(cè)結(jié)果表明，苜蓿素作用72 h后，細(xì)胞出現(xiàn)G0/G1期堆積，G2/M細(xì)胞的比例明顯降低;細(xì)胞凋亡比例開(kāi)始上升，由中濃度時(shí)的7.87%，上升為高濃度時(shí)的16.04%，揭示苜蓿素可以阻滯SW1116細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(見(jiàn)表1;圖3)。

圖3 苜蓿素對(duì)SW1116細(xì)胞生長(zhǎng)周期的影響圖Fig.3 Effect of tricin on cell cycle distribution

3.4 瓊脂糖凝膠電泳觀察DNA結(jié)構(gòu)變化

SW1116細(xì)胞經(jīng)不同濃度的苜蓿素作用72 h后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳譜顯示，出現(xiàn)“階梯狀”DNA Ladder帶，大小分別約為100～200 bp，細(xì)胞發(fā)生凋亡。陰性對(duì)照組細(xì)胞未見(jiàn)DNA Ladder，4 μg/mL苜蓿素作用72 h，開(kāi)始出現(xiàn)DNA Ladder，且隨著給藥濃度的加大，DNA Ladder條帶越明顯，表明苜蓿素能引起細(xì)胞內(nèi)DNA發(fā)生斷裂，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

圖4 DNA斷裂電泳分析Fig.4 DNA fragmentation electrophoresis

3.5 苜蓿素對(duì)SW1116細(xì)胞相關(guān)蛋白的影響

用苜蓿素 60，20，2 μg/mL 作用 SW1116 細(xì)胞72 h后，Western blot檢測(cè)凋亡調(diào)控蛋白Bcl-2和Bax的水平。隨苜蓿素劑量增大，抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白水平逐漸變淡，苜蓿素60 μg/mL下調(diào)作用最明顯，而促凋亡蛋白Bax條帶灰度則逐漸增粗，呈量效關(guān)系(見(jiàn)圖5)。

圖5 苜蓿素對(duì)SW1116細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響Fig.5 The influence of protein expression on SW1116 cells by tricin

4 討論

癌癥嚴(yán)重威脅著人類的健康和生命安全，目前發(fā)病率和死亡率均呈逐年上升趨勢(shì)。因此，研究高效、低毒的抗癌藥物具有重要意義，而從中草藥中尋找高效、低毒的抗腫瘤成分已經(jīng)成為現(xiàn)代抗腫瘤藥物發(fā)展的熱點(diǎn)之一［6］，如紫杉醇、喜樹(shù)堿、雷公藤內(nèi)堿、三尖杉酯堿等。蒲葵子為棕櫚科蒲葵屬植物蒲葵Livistona chinensis(Jacq.)R.Br．的種子，民間廣泛用其治療各種癌癥，現(xiàn)代藥理學(xué)研究也證實(shí)其抗癌療效顯著［7-12］。由于迄今蒲葵子抗腫瘤的藥效基礎(chǔ)尚不明確，特別是有效成分及其機(jī)制缺乏系統(tǒng)研究。本實(shí)驗(yàn)室對(duì)蒲葵子進(jìn)行系統(tǒng)的分離，其中分離得到的苜蓿素是一種天然的黃酮成分，且其在蒲葵子中的含量較高［13］，因此對(duì)其活性進(jìn)行研究。

本實(shí)驗(yàn)采用不同濃度的苜蓿素處理SW1116細(xì)胞，AO/EB熒光染色分析，出現(xiàn)凋亡的典型特征，并可見(jiàn)凋亡小體。通過(guò)DNA電泳譜顯示，SW1116細(xì)胞經(jīng)不同濃度的苜蓿素作用72 h后，出現(xiàn)“階梯狀”DNA Ladder帶，且給藥濃度越大，DNA Ladder條帶越明顯，提示苜蓿素導(dǎo)致SW1116細(xì)胞核酸內(nèi)切酶激活DNA降解，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。另外，采用流式細(xì)胞儀分析了各時(shí)相的細(xì)胞周期分布情況，結(jié)果顯示苜蓿素可以阻滯細(xì)胞周期，使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生選擇性的G0/G1期堆積，影響細(xì)胞生長(zhǎng)，從而抑制細(xì)胞增殖。

Bcl-2是一種原癌基因，其家族成員分兩類，如Bcl-X1、Mcl-1、Bcl-2 等抑制凋亡的蛋白和 Bax、Bad、Bak、Bid等促凋亡蛋白［14］。當(dāng) Bc1-2過(guò)表達(dá)時(shí)，與Bax形成異二聚體抑制細(xì)胞凋亡;相反，Bax過(guò)表達(dá)時(shí)，Bax形成同源二聚體促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Bcl-2和Bax對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控不僅取決于自身表達(dá)水平高低，還與兩者的比例有關(guān)。當(dāng)Bcl-2/Bax比例減少時(shí)，導(dǎo)致游離型Bax蛋白相對(duì)增多。而游離型Bax可以使線粒體外膜發(fā)生滲漏化(mitochondrial outer membrane permeabilization，MOMP)，引發(fā)經(jīng)線粒體途徑介導(dǎo)的細(xì)胞死亡［15］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)蛋白免疫印跡法檢測(cè)了Bcl-2和Bax蛋白水平，用苜蓿素處理SW1116細(xì)胞72 h后，Bcl-2蛋白表達(dá)低于對(duì)照組，而Bax表達(dá)增強(qiáng)。苜蓿素引起B(yǎng)cl-2/Bax比例減少，是通過(guò)死亡受體途徑及線粒體途徑引起細(xì)胞凋亡，從而抑制細(xì)胞增殖。

由此可推知，苜蓿素為蒲葵子可能的有效成分之一，提取分離工藝穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，可以大量制備。另外也說(shuō)明苜蓿素可能通過(guò)阻滯細(xì)胞周期及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡共同作用來(lái)發(fā)揮抗腫瘤作用，為蒲葵子活性評(píng)價(jià)提供可靠的依據(jù)。

1 Zhou JM，Ibrahim RK.Tricin—a potential multifunctional nutraceutical.Phytochem，2010，9:413-424.

2 Hudson EA，Dinh PA，Kokubun T，et al.Characterization of potentially chemopreventive phenols in extracts of brown rice that inhibit the growth of human breast and colon cancer cells.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2000，9:1163-1170.

3 Cai H，Hudson EA，Mann P，et al.Growth-inhibitory and cell cycle-arresting properties of the ricebran constituent tricin in human-derived breast cancer cells in vitro and in nude mice in vivo.Br J Cancer，2004，91:1364-1371.

4 Cai H，Al-Fayez M，Tunstall RG，et al.The rice bran constituent tricin potently inhibits cyclooxygenase enzymes and interferes with intestinal carcinogenesis in ApcMinmice.Mo Cancer Ther，2005，4:1287-1292.

5 Lou YC(樓一層)，Huang F(黃芬)，Yan XF(顏香鳳)，et al.Induction effect of n-butyl-β-D-fructosidepyranose on apoptosis bel-7402 cells in vitro.Chin Hosp Pharm J(中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志)，2009，29:1253-1255.

6 Rocha AB，Lopes RM，Schwartsmann G.Natural products in anticancer therapy.Curr Opin Pharmacol，2001，1:364-369.

7 Editorial Board of Zhong-Hua-Ben-Cao(China Herbal)，State Administration of Traditional Chinese Medicine(國(guó)家中醫(yī)藥管理局＜中華本草＞編委會(huì)).China Bencao(中華本草).Shanghai:Shanghai Science ＆ Technology Press，1999.460.

8 Guangzhou Forces General Logistics Department of Health(廣州部隊(duì)后勤部衛(wèi)生部).Chinese Herbal Medicin Handbook(常用中草藥手冊(cè)).Beijing:People's Health Publishing House，1969:772-773.

9 Juangsu New Medical College(江蘇新醫(yī)學(xué)院).Dictionary of Chinese Herbal Medicine(中藥大辭典，下)，Shanghai:Shanghai Science ＆ Technology Press，2006.3430.

10 Sartippour MR，Liu CH，Shao ZM，et al．Livistona extract inhibits angiogenesis and cancer growth.Oncol Rep，2001，8:1355-1357.

11 Cheung Susan，Tai Joseph.In vitro studies of the dry fruit of Chinese fan palm Livistona Chinensis.Oncol Rep，2005，14:1331-1336.

12 Huang WC，Hsu RM，Chi LM，et al.Selective downregulation of EGF receptor and downstream MAPK pathway in human cancer cell lines by active components partially purified from the seeds of Livistona chinensis R.Brown.Cancer Lett，2007，248:137-146.

13 Chen Y(陳艷)，Yao H(姚宏)，Li SG(李少光)，et al.HPLC detemination of the six components in Livistona chinensis.Chin J Pharm Anal(藥物分析雜志)，2011，31:645-650.

14 Fujie Y，Yamamoto H，Ngan CY，et al.Oxaliplatin，a potent inhibitor of surviving，enhances paclitaxel-induced apoptosis and mitotic catastrophe in colon cancer cells.Jpn J Clin Oncol，2005，35:453-463.

15 Chipuk JE，Green DR.How to BCL-2 proteins induce mitochondrial outer membrane permebilization?Trends Cell Biol，2008，18:157-164.