佟春玉，孫越春，秦學(xué)功，葛文忠，崔玉東

黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319

天門(mén)冬，百合科植物。又名天冬。性寒，味甘，微苦。作為一種傳統(tǒng)的中藥，具有養(yǎng)陰清熱，潤(rùn)肺滋腎的功效。用于治陰虛發(fā)熱、咳嗽吐血、肺癰、咽喉腫痛、消渴、便秘等病癥［1］。多糖作為一種免疫調(diào)節(jié)和促進(jìn)劑，對(duì)巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(NK)和淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞(LAK)的功能都有調(diào)節(jié)作用。天門(mén)冬多糖(Asparagus cochinchinensis polysaccharide，ASP)是從中藥天門(mén)冬中提取的生物活性成分，據(jù)報(bào)道具有清除自由基及抗脂質(zhì)過(guò)氧化活性。近年來(lái)，研究人員發(fā)現(xiàn)ASP可以刺激豬和小鼠的體外T、B淋巴細(xì)胞增殖，但其在體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)卻未見(jiàn)報(bào)道［2，3］。因此，本研究采用環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠模型，研究ASP對(duì)免疫抑制小鼠的保護(hù)作用，為未來(lái)ASP的臨床應(yīng)用提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康Balb/c小鼠，SPF級(jí)，雄性，6～8周齡，體重(20±2)g，購(gòu)于吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào):SCXK(吉2003-0001)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

ASP購(gòu)自西安斯諾特生物技術(shù)有限公司，刀豆蛋白A(Con A IV型)、脂多糖(LPS)、環(huán)磷酰胺(CTX)均為Sigma產(chǎn)品;細(xì)胞因子試劑盒購(gòu)于美國(guó)Biolegend公司，RPMI-1640完全培養(yǎng)基(含100 IU/mL青霉素、100 g/L鏈霉素、1%谷氨酰胺和10%滅活新生胎牛血清，pH 7.2)為Gibco產(chǎn)品;胎牛血清、DMSO、生理鹽水均是國(guó)產(chǎn)產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組及給藥

小鼠50只，雌雄各半，隨機(jī)分成5組，對(duì)照組(生理鹽水)，模型組，天門(mén)冬多糖高、中、低劑量組，連續(xù)給藥7 d，給藥第3 d，除對(duì)照組外，其他各組小鼠均腹腔注射CTX 50 mg/kg，連續(xù)3 d，建立免疫抑制小鼠模型。

1.3.2 臟器指數(shù)測(cè)定

7d后，稱重，頸椎脫臼處死小鼠，分離胸腺和脾臟稱濕重，以小鼠胸腺或脾臟重/體重(mg/g)作為胸腺指數(shù)或脾臟指數(shù)。

1.3.3 免疫抑制小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)測(cè)定

無(wú)菌條件下制備Balb/c小鼠脾細(xì)胞懸液加入到96孔板中，每孔100 μL，調(diào)整脾細(xì)胞濃度為5×106個(gè)細(xì)胞/mL，此后，加入 Con A(終濃度 5 μg/mL)或 LPS(終濃度 20 μg/mL)100 μL，使終體積為200 μL并各設(shè)三個(gè)復(fù)孔。96孔板置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)44 h后，每孔加入20 μL的MTT(5 mg/mL)再繼續(xù)培養(yǎng)4 h。4 h后移除培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO震搖10 min，在570 nm測(cè)量吸光值。

1.3.4 免疫抑制小鼠血清細(xì)胞因子含量的檢測(cè)

小鼠第7 d給藥后摘除眼球取血并分離血清，采用雙抗體夾心ELISA法測(cè)定血清IL-2和IL-4含量，參考試劑盒使用說(shuō)明書(shū)步驟操作，于450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度，根據(jù)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算IL-2和IL-4含量。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn);多組計(jì)量資料采用one-way ANOVA，方差齊時(shí)采用LSD法，方差不齊時(shí)采用Dunnett's T3法。P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 ASP對(duì)免疫抑制小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響

ASP對(duì)脾臟指數(shù)的影響如表1所示，與空白組相比，CTX組的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)顯著降低，而ASP各劑量組的胸腺指數(shù)脾臟指數(shù)明顯升高(P＜0.01)，說(shuō)明ASP在一定的劑量范圍內(nèi)可以緩解CTX對(duì)小鼠的免疫抑制作用。

表1 ASP對(duì)CTX引起的免疫低下小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響(±s)Table 1 Effects of ASP on thymus and spleen index in immunosuppressed mice(±s)

表1 ASP對(duì)CTX引起的免疫低下小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響(±s)Table 1 Effects of ASP on thymus and spleen index in immunosuppressed mice(±s)

注:與對(duì)照組相比，##P＜0.01;與CTX組相比，＊＊P＜0.01。Note:##P＜0.01vs.Control group;＊＊P＜0.01 vs.CTX group.

組別Group濃度Concentration(mg/kg)胸腺指數(shù)Thymus index(mg/g)脾臟指數(shù)Spleen index(mg/g)空白組Control Group - 2.57±0.09 5.19±0.06 CTX組CTX Group CTX(50) 1.35±0.07## 3.08±0.19##實(shí)驗(yàn)組 Experimental Group 10+CTX(50) 1.73±0.11＊＊ 4.20±0.18＊＊20+CTX(50) 2.16±0.09＊＊ 4.53±0.10＊＊40+CTX(50) 2.53±0.08＊＊ 4.84±0.12＊＊

2.2 ASP對(duì)免疫抑制小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響

圖1 ASP對(duì)脾淋巴細(xì)胞體內(nèi)增殖的影響Fig.1 Effect of ASP on splenocyte proliferation in vivo

ASP對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響如圖1所示。ConA或LPS刺激脾淋巴細(xì)胞會(huì)引起細(xì)胞增殖，而50 mg/kg的CTX能有效地抑制ConA或LPS刺激脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)(P＜0.01)。與此相反，ASP加上CTX可以有效地緩解CTX對(duì)脾細(xì)胞增殖反應(yīng)的抑制作用，并呈劑量依賴的方式。

2.3 ASP對(duì)免疫抑制小鼠血清細(xì)胞因子IL-2和IL-4的影響

ASP對(duì)免疫抑制小鼠血清中主要細(xì)胞因子水平的影響如圖2所示，我們使用ELISA方法檢測(cè)小鼠血清中的IL-2和IL-4的細(xì)胞因子水平。從圖中可以看出，CTX組血清中的細(xì)胞因子IL-2和IL-4比對(duì)照組顯著降低(P＜0.01);與CTX組相比，當(dāng)ASP組劑量為20 mg/kg或40 mg/kg時(shí)，免疫抑制小鼠血清中的IL-2和IL-4的水平都顯著提高(P＜0.01)。

圖2 ASP對(duì)免疫抑制小鼠血清中IL-2和IL-4分泌水平的影響Fig.2 Effect of ASP on serum IL-2 and IL-4 of immunosuppressed mice

3 討論

環(huán)磷酰胺為氮芥與磷酰胺基結(jié)合而成的化合物，是臨床常用的烷化劑類(lèi)免疫抑制劑?？捎糜谥委煾鞣N自身免疫性疾病，即能抑制細(xì)胞增殖，非特異性殺傷抗原敏感性小淋巴細(xì)胞，限制其轉(zhuǎn)化為免疫母細(xì)胞［4］。本文采用CTX所致免疫低下小鼠模型，研究ASP對(duì)免疫抑制小鼠免疫功能的影響，探討ASP的免疫藥理效應(yīng)，摸索其最佳劑量范圍。

眾所周知，細(xì)胞有絲分裂原ConA可以刺激T淋巴細(xì)胞增殖，LPS可以刺激B淋巴細(xì)胞增殖，T淋巴細(xì)胞主要參與機(jī)體的細(xì)胞免疫反應(yīng)，B淋巴細(xì)胞主要參與體液免疫反應(yīng)［5-7］。在體內(nèi)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，采用MTT法測(cè)定ASP對(duì)LPS和ConA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示ASP可以緩解CTX組對(duì)小鼠脾細(xì)胞體內(nèi)增殖反應(yīng)的抑制作用，因此說(shuō)明ASP通過(guò)細(xì)胞免疫和體液免疫兩種方式參與機(jī)體免疫反應(yīng)，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴模式。

細(xì)胞因子能介導(dǎo)和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，檢測(cè)細(xì)胞因子分泌水平可以密切反映機(jī)體的免疫狀態(tài)。IL-2主要由TH1細(xì)胞分泌，參與細(xì)胞免疫反應(yīng);IL-4主要由TH2細(xì)胞分泌，參與體液免疫反應(yīng)［8-10］。本研究中，在CTX誘導(dǎo)小鼠免疫功能抑制的基礎(chǔ)上，給予ASP，可顯著增加小鼠血清中IL-2、IL-4含量。表明ASP對(duì)CTX誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠的免疫功能具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用，能提高小鼠的免疫防御功能。

綜上可見(jiàn)，ASP可以消除CTX誘導(dǎo)的小鼠免疫抑制作用，對(duì)臨床具有一定的應(yīng)用價(jià)值，未來(lái)需對(duì)ASP免疫增強(qiáng)機(jī)制進(jìn)一步研究，為其臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

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3 Kang L(康樂(lè))，Yao DB(姚東璧)，Hu TJ(胡庭俊)，et al．The effect of Asparagus cochinchinensis polysaccharide on proliferation of splenic lymphocytes from mice in vitro.Chin J Anim Hus Vet Med(中國(guó)畜牧獸醫(yī))，2010，37:15-17.

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