邱 靖，陳永勝 ，穆莎茉莉，李國瑞

1內(nèi)蒙古民族大學農(nóng)學院;2內(nèi)蒙古民族大學生命科學院;3內(nèi)蒙古自治區(qū)高校蓖麻產(chǎn)業(yè)研究中心，內(nèi)蒙古自治區(qū)通遼028000

蓖麻堿是蓖麻中主要毒素之一，主要存在于蓖麻的莖葉和種子中，在幼嫩的子葉中含量較高，在植株不同的部位其含量有所不同，籽殼中含1.5%，幼嫩綠葉中含0.7% ～1.0%，種子中含0.1% ～0.2%，未脫毒的蓖麻餅中含 0.3% ～0.4%［1，2］。蓖麻堿為白色針狀或棱柱狀結(jié)晶體，其學名為3-氰基-4-甲氧基-1-甲基-2-吡啶酮，分子式為 C8H8N2O2，分子量為164.17，熔點為201.5℃，在170～180℃、2667kPa 20S時有升華［3］。蓖麻堿是一種中性的生物堿，其水溶性呈中性，與酸反應不易形成鹽，堿性溶液能使高錳酸鉀還原，同時還生成氫氰酸，因為蓖麻堿分子中含有氰基，其毒性很大，對人可引起嘔吐、惡心，嚴重時呼吸衰竭而死，對家禽毒性作用較強，是一種能導致甲狀腺腫大的潛在因子［4，5］。蓖麻堿有一定的殺蟲和鎮(zhèn)痛作用，對天幕毛蟲、小菜蛾、桃蚜等害蟲有不同程度的殺滅［6］。

超聲提取原理是利用超聲波在液體中產(chǎn)生的空化效應、熱效應和機械作用。當大能量的超聲波作用于介質(zhì)時所產(chǎn)生的大氣壓的瞬間壓力破壞液體中植物細胞和細胞膜結(jié)構(gòu)，從而增加細胞內(nèi)溶物通過細胞膜的穿透能力，有助于蓖麻堿的釋放和溶出;超聲波使提取液不斷震蕩，有助于溶質(zhì)擴散，縮短了破碎提取時間，同時超聲波產(chǎn)生的振動作用加強了胞內(nèi)物質(zhì)的釋放、擴散和溶解，提高了有效成分的提取率和原料的利用率［7，8］。

本試驗研究了以新鮮綠葉為提取原料，采用響應面方法優(yōu)化超聲波提取蓖麻堿的工藝條件。目前國內(nèi)對蓖麻堿提取主要以蓖麻餅粕原料，然而至今還未有以新鮮的綠葉為原料的相關(guān)報道，在此方法的提取過程中工藝及處理方法有所不同。以綠葉為原料時，必須對綠葉中葉綠素進行處理，避免葉綠素對蓖麻堿含量測定的干擾。而國內(nèi)對蓖麻堿的提取常用方法有回流提取法、微波提取法，以超聲波輔助提取蓖麻堿的工藝尚無報道。因此本文采用響應面分析法優(yōu)化超聲波提取蓖麻堿，并通過實驗獲得最佳提取工藝參數(shù)能，夠取得較好的效果。此方法測定蓖麻葉、莖、中蓖麻堿的含量為今后的研究提供參考，從而為進一步開發(fā)利用蓖麻堿提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

通蓖6嫩葉(大田采樣);蓖麻堿標準樣品(實驗室自制，經(jīng)過高效液相色譜，核磁共振檢驗純度為99.8%);甲醇、乙醇、三氯甲烷均為國產(chǎn)分析純;蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

VCX130型超聲波儀，美國Sonics＆Materials公司;紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司;DHG-9240型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠;TDL-5低速臺式大容量離心機，珠海黑馬醫(yī)學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蓖麻堿提取工藝

蓖麻葉→擦凈→去除葉脈→85%丙酮溶液浸泡(除葉綠素)→烘干→粉碎→溶劑超聲提取→離心→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)→蓖麻堿。

1.3.2 蓖麻堿標準曲線的繪制

按照參考文獻［9］的方法精密稱取蓖麻堿標準品10 mg，置10 mL容量瓶中，用甲醇溶解，并稀釋定容后得到1 mg/mL蓖麻堿標準溶液。從標準溶液中準確吸取蓖麻堿標準溶液 0、200、400、600、800、1000 μL分別置100 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，使其濃度分別為 0、2、4、6、8、10 μg/mL的蓖麻堿溶液，室溫下靜置30 min;用紫外分光光度計，以甲醇為空白對照品，在波長314 nm處測定吸光度，以吸光度為橫坐標，蓖麻堿濃度為縱坐標作標準曲線，得線性回歸方程:Y=0．0593X-0．0044，R2=0.9991。

1.3.3 蓖麻堿提取率的計算

式中:C:提取液中蓖麻堿濃度;V:溶解蓖麻堿所用甲醇體積;m:蓖麻葉粉末質(zhì)量。

1.3.4 單因素實驗

1.3.4.1 提取溶劑對提取率的影響

準確稱取蓖麻葉粉末1 g，放入燒杯中，設(shè)定超聲溫度為60℃，時間為120 min，提取料液比為1∶20 g/mL，功率600 W。分別以甲醇、乙醇、三氯甲烷、水為提取溶劑。提取后離心，5000 rpm，離心20 min。取上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)蒸干溶劑后，用甲醇溶解并稀釋到刻度定容于100 mL容量瓶中，測定吸光度，確定最佳提取溶劑。

1.3.4.2 提取料液比對提取率的影響

準確稱取蓖麻葉1 g，加甲醇進行提取，以超聲功率為600 W、溫度為60℃，時間為120 min，在不同料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL)的條件下進行提取，同上1.3.4.1步驟操作，測定吸光度，確定最佳提取料液比。

1.3.4.3 超聲提取時間對提取率的影響

準確稱取蓖麻葉1 g，以甲醇為提取溶劑，提取料液比為1∶20 g/mL、超聲功率為600 W、溫度為60℃，在不同提取時間(30、60、90、120、150 s)的條件下進行提取。同上1.3.4.1操作測定吸光度，確定最佳超聲時間。

1.3.4.4 超聲提取溫度對提取率的影響

準確稱取蓖麻葉1 g，以甲醇作為溶劑，提取料液比為1∶20 g/mL、超聲功率600 W、在不同提取溫度(30、40、50、60、70 ℃)的條件下提取120 min。同上1.3.4.1操作，測定吸光度，確定最佳超聲溫度。

1.3.4.5 超聲提取功率對提取率的影響

準確稱取1 g蓖麻葉，以甲醇為溶劑，提取料液比為1∶20 g/mL，超聲溫度為60℃，時間為 120 min，在不同超聲功率(400、500、600、700、800 W)的條件下進行提取。同上1.3.4.1操作，測定吸光度，確定最佳超聲功率。

1.3.5 響應面試驗設(shè)計

響應面設(shè)計［10］，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，以蓖麻堿提取率為響應值Y，選出影響最顯著的因素:料液比、超聲時間、超聲功率，進行三因素三水平的響應面試驗。實驗因素與水平見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 提取溶劑對蓖麻堿提取率的影響分析

表1 響應面試驗因素水平及編碼表Table 1 Level and code of response surface experiments

圖1 提取溶劑(甲醇、乙醇、三氯甲烷、水)對蓖麻堿提取率的影響Fig.1 Effects of extraction solvent(methanol，alcohol，chloroform，H2O)on the extraction yield of ricinine

由圖1可知，在相同提取條件下，三氯甲烷為溶劑所得到的蓖麻堿提取率為最高;而以甲醇為提取溶劑所到的蓖麻堿提取率略低于三氯甲烷;乙醇為提取溶劑所得到的蓖麻堿提取率低于三氯甲烷;以水為提取溶劑所得到的蓖麻堿提取率最低。因三氯甲烷是有毒氣體，且甲醇提取率略低于三氯甲烷，故選擇甲醇最適宜。

2.1.2 提取料液比對蓖麻堿提取率的影響分析

圖2 料液比對蓖麻堿提取率的影響Fig.2 Effects of ratio of sample to solvent on extraction yield of ricinine

由圖2可知，料液比為1∶20 g/mL時，蓖麻堿提取率達到最高。蓖麻堿提取率隨著提取溶劑的增加而增加，料液比增加，細胞內(nèi)外濃度差增加，內(nèi)擴散速度增加，有利于蓖麻堿的溶出。但當溶劑用量達到一定程度時，蓖麻堿的提取率開始減小，此時如果繼續(xù)增加提取溶劑的用量，提取溶劑過多，提取液濃度會隨之下降，提取率就會減小。因此提取料液比以1∶20 g/mL為最佳。

2.1.3 超聲時間對蓖麻堿提取率的影響分析

圖3 超聲時間對蓖麻堿提取率的影響Fig.3 Effects of ultrasonic time on extraction yield of ricinine

由圖3可知，隨著超聲時間的增加，蓖麻堿的提取率也隨之增加，當超聲時間為120 min時提取率達到最高。其原因是超聲波的空化效應。空化效應造成細胞壁的破壞，蓖麻堿等物質(zhì)向溶液中擴散，蓖麻堿提取率此時達到最高值。因此超聲時間為120 min為最佳提取。

2.1.4 超聲提取溫度對蓖麻堿提取率的影響

圖4 超聲波溫度對蓖麻堿提取率的影響Fig.4 Effects of ultrasonic temperature on extraction yield of ricinine

圖5 超聲波功率對蓖麻堿提取率的影響 Effects of ultrasonic power on extraction yield of ricinine

由圖5可知，隨著超聲功率的增加，蓖麻堿的提取率增加，當功率增加至600 W時，蓖麻堿的提取率達到最大值。而后又隨超聲功率的增加，蓖麻堿提取量隨之緩慢減少。因此，超聲功率為600 W為宜。

2.2 響應面試驗結(jié)果

2.2.1 回歸方程及方差分析

CCD實驗設(shè)計結(jié)果見表2，利用Design Expert 8軟件對實驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，得到蓖麻堿提取率與各因素變量的二次回歸方程:

表2 CCD實驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and results of CCD tests

表3 回歸方程模型方差分析Table 3 Analysis variance for regression equation model

注:＊＊P ＜0.001，very significant;*P ＜0.050，statistical significance;P＞0.050 non-significant。

由回歸方程模型方差分析表3可知，模型P＜0.0001，回歸模型極顯著。模型中一次項x3極顯著，x1、x2顯著;互交項 x1x2顯著;二次項極顯著;結(jié)果表明，各因素對蓖麻堿提取率的影響不是簡單的線性關(guān)系。失擬項P=0.4856＞0.05，不顯著，相關(guān)系數(shù)R2=0.9858，說明模型擬合程度良好，該模型可以較好的分析超聲法提取蓖麻堿提取率。

2.2.2 響應曲面分析

通過響應面圖可以直觀的看出各因素和各因素之間的交互作用對蓖麻堿提取率的影響，根據(jù)回歸方程做響應面三維圖，比較響應面三維圖可看出，在所選范圍之內(nèi)存在著極值，即為響應面最高點;等高線的形狀反映交互作用的大小，圓形表示兩因素的交互作用不顯著，橢圓形則表示兩因素交互作用顯著。比較3組響應面及等高線分析圖可知:超聲時間和料液比對蓖麻堿提取率的交互作用極顯著;其次超聲功率和超聲時間、料液比和超聲功率對蓖麻堿提取率對蓖麻堿提取率的交互作用顯著。

2.2.3 提取工藝條件的確定與驗證

提取工藝的優(yōu)化與實驗驗證為確定超聲波提取靈芝的最佳工藝參數(shù)，對擬合的回歸方程分別求3個變量的一階偏導，并令其值為0，可得到個因素的編碼值:x1=0.99，x2=-0.57，x3=0.21，轉(zhuǎn)換后得到最佳提取工藝條件為:超聲時間103.03 min、超聲功率621.05 W、料液比1∶25 g/mL，理論預測提取率為2.65‰。為了檢驗響應面法優(yōu)化超聲波提取蓖麻堿工藝結(jié)果的可靠性，根據(jù)得到的優(yōu)化條件進行3次驗證實驗，結(jié)果顯示，實驗平均值為2.63‰，與預測的最大響應值相對標準偏差為0.02‰。說明該方程與實驗情況擬合很好，響應面法對蓖麻堿超聲波提取工藝的優(yōu)化是可行的。

3 結(jié)論

本實驗在單因素實驗的基礎(chǔ)上，將響應面分析法應用于優(yōu)化超聲波提取蓖麻堿的條件?；貧w方程模型方差分析結(jié)果表明超聲時間和料液比對蓖麻堿提取率的交互作用極顯著;其次超聲功率和超聲時間、料液比和超聲功率對蓖麻堿提取率對蓖麻堿提取率的交互作用顯著，這3個因素對蓖麻堿提取率的影響不是簡單的線性關(guān)系。

蓖麻堿提取率的響應曲面的回歸方程模型方差分析和驗證實驗表明此方法可行。所得超聲波法提蓖麻堿的最佳工藝為:以甲醇為提取溶劑，超聲時間103.03 min、超聲功率621.05 W、料液比1∶25 g/mL，蓖麻堿的理想預測值為 2.65‰，驗證值為2.63‰，與預測值的相對誤差為0.02‰。

1 Wen YM(溫燕梅)，F(xiàn)eng YF(馮亞非)，Zheng MZ(鄭明珠)，et al.Extraction and content of the ricinine for different parts of Ricinus communis.Agrochemicals，2008，47:584-606.

2 Zheng C(鄭成)，Xu LZ(許麗珠)，Gao XM(高曉明)，et al.Study on the extraction，purification，and recomposition of the ricinine and its insecticidal effects.Nat Prod Res Dev，2007，19:785-790.

3 Zhang XH(張小紅)，Li CL(李翠麗)，Yu JJ(于俊杰)，et al.Separation and determination of ricinine from Ricinus Semen.Chin J New Drugs，2011，20:1741-1744.

4 Yuldashev PKh.Ricinine and its transformation.Chem Nat Comp，2001，27:274-275.

5 Jiang XH，Song GQ.The comprehensive development and utilization of castor bean meal.J Zhongkai Agrotech College，2001，14:54-59.

6 Zhao ZL(趙增林)，Zhao W(趙偉)，Zhang HY(張海悅)，et al.Biological activity of ricinine.China Brew，2009，207(6):13-14.

7 Park SY，Chang SY，Oh OJ，et al.Nor-oleanene type triterpene glycosides from the leaves of Acanthopanax Japonicas.Phytochemistry，2002，59:379-384.

8 Wei LY，Wang JH，Zheng XD，et al.Studies on the extracting technical conditions of inulin from Jerusalem artichoke tubers.J Food Eng，2007，79:1087-1093.

9 Xu WQ(徐文清)，Chen A(陳艾)，Zhuang XL(莊湘蓮)，et al.Quantity determination of ricinine in Castor Pomace by ultroviolet spectrometry method.China Oil，2001，26(2):45-46.

10 Gupta S，Manohar CS.An improved response surface method for the determination of failure probability and importance measures.Structural Safety，2004，26:123-132.