連芳 黃超源 鄔國斌

·論著·

乙型肝炎病毒PreS/S基因真核表達質(zhì)粒的構建

連芳 黃超源 鄔國斌

目的 克隆乙肝病毒PreS/S基因及構建真核表達質(zhì)粒。方法 以HBSAg陽性患者DNA為模板PCR法擴增PreS/S基因, PCR產(chǎn)物測序分析正確后克隆至真核表達載體pcDNA3.1。結(jié)果 酶切鑒定和序列分析證實構建質(zhì)粒含PreS/S基因。結(jié)論 PreS/S基因克隆及其真核表達質(zhì)粒構建成功可用于肝癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學研究。

乙肝病毒；PreS/S基因；質(zhì)粒

乙肝病毒(hepatitis B virus, HBV)是肝細胞癌發(fā)生的主要病因已成定論, 而其作用的分子機制尚未闡明。具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的乙肝病毒PreS/S基因在病毒復制、炎癥反應、肝細胞惡變等分子調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用。針對PreS/S基因生物功能的研究已經(jīng)成為揭示肝細胞癌變分子機制的熱點, 構建PreS/S基因真核表達質(zhì)粒將對進一步研究HBV在肝癌形成中的作用提供有力的工具和手段。

1 實驗材料

1.1 臨床標本 取標本庫內(nèi)8例臨床HBSAg陽性患者血液標本10 ml。

1.2 菌株、質(zhì)粒、工具酶和試劑 pGEM-T vector system I擴增載體質(zhì)粒系統(tǒng)；pCDNA3.1載體質(zhì)粒；大腸桿菌感受態(tài)TG1；限制性核酸內(nèi)切酶Kpn I和HinD III；DNA連接酶；TapDNA聚合酶；PCR產(chǎn)物純化膠回收試劑盒：質(zhì)粒抽提試劑盒；基因組DNA抽提試劑盒；RNA提取試劑盒等由廣西腫瘤防治研究所綜合實驗室提供。

1.3 儀器 紫外分光光度儀；PCR儀。

1.4 數(shù)據(jù)庫及軟件 參考網(wǎng)上Genbank、Pfam等數(shù)據(jù)庫；使用primer5.0 , vector NTI suite8.0軟件分析基因及蛋白序列及設計引物。

2 實驗方法

2.1 基因組DNA提取 取標本庫保存的慢性乙型肝炎患者血液標本(標示1～8號)按照DNA試劑盒流程分別提取基因組DNA, 備PCR模板待用。

2.2 引物設計 根據(jù)HBVDNA全序列(Genbank)及參照文獻,運用primer 5.0軟件設計PreS/S基因序列引物, 上游引物 PC3 Sen 5′ -AAGCTT-GCCGCCACCATGGGAGGTTGGTCATC-3′,下游引物 PC3 Anti5′ -GGTACC-TTAAATGTATACCCAAAGACAGAAGAAAATTGG-3′,引物5′端分別引入了HinIII(AAGCTT), KpnI(GCTACC)的酶切位點。

2.3 PCR反應條件 預變性95℃ 3 min；變性95℃ 30s；退火55℃ 30 s；延伸72℃ 1 min共30個循環(huán)；最后延伸72℃30 min。PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖膠電泳鑒定大小。

2.4 PCR產(chǎn)物的克隆及序列測定 切下1%瓊脂糖凝膠電泳正確片段, 按照膠回收試劑盒操作說明回收PCR產(chǎn)物, 連接T載體, 轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞TG1細菌克隆后提取質(zhì)粒, 經(jīng)HinIII、KpnI雙酶切后進行1%瓊脂糖凝膠電泳, 切出目的基因條帶的為陽性克隆質(zhì)粒, 送至生物公司測序鑒定產(chǎn)物序列。

2.5 PCR產(chǎn)物序列分析 用Vector NTI Suite8.0軟件和Primer 5.0軟件比對分析PCR產(chǎn)物序列并預測相應蛋白, 利用網(wǎng)上Pfam數(shù)據(jù)庫推斷相應蛋白家族起源。

2.6 PreS/S基因真核表達質(zhì)粒構建 序列確證后, 取pcDNA3.1質(zhì)粒及PCR產(chǎn)物質(zhì)粒分別用HinIII KpnI雙酶切并1%瓊脂糖凝膠電泳, 切取pcDNA3.1酶切載體片段及目的片段, 膠回收后, 載體片段和目的片段混合用DNA連接酶連接反應。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞TG1?？寺『Y選后抽提質(zhì)粒, 再用HinIII、KpnI雙酶切并1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

3 結(jié)果

3.1 PCR產(chǎn)物克隆 PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳結(jié)果示5、7號標本擴增出大小1200bp的條帶(圖1)。膠回收5、7號目的片段分別連接至T載體感受態(tài)克隆, 克隆篩選后各取3個搖菌抽提質(zhì)粒, 5號目的片段克隆菌標記為1～3號, 7號目的片段克隆菌4～6號。HinIII、KpnI雙酶切后電泳結(jié)果提示1～6號質(zhì)粒均含有1200bp目的片段(圖2)。

圖1 以8個血液標本DNA為模板PCR擴增, 其中5、7號標本擴增出大小約1200bp目的片段。M為market, 1～8為血液標本DNA標本號。

圖2 膠回目的片段分別連接至T載體感受態(tài)并克隆菌1～6號HinIII、KpnI雙酶切后電泳結(jié)果均含有1200bp目的片段。M 為market, 1～6為克隆菌號

3.2 PCR產(chǎn)物序列分析 搭載PCR產(chǎn)物的載體質(zhì)粒, 送測序。測序結(jié)果提示PCR產(chǎn)物包含1203pb堿基的LHBs序列, 該PCR堿基序列翻譯蛋白在Pfam數(shù)據(jù)庫中比對分析,結(jié)果提示該蛋白與乙肝病毒主要表面蛋白家族(PF00695)匹配(E值 1.0)。種源樹狀分析與C亞型乙肝病毒(HBSAG_HPBDB/1-329, HBSAG_HHBV/1-332)同源。(圖3)

圖3 目的片段分析結(jié)果提示與C亞型乙肝病毒同源。

3.3 PreS/S基因真核表達質(zhì)粒電泳鑒定 構建的PreS/S基因真核表達質(zhì)粒再用HinIII、KpnI雙酶切并電泳, 酶切出大小約1200bp的目的片段。(圖4)

圖4 構建的PreS/S基因真核表達質(zhì)粒用HinIII、KpnI雙酶切并電泳驗證, 酶切出大小約1200 bp的目的片段。M 為market, 1～2為質(zhì)粒標本號

4 討論

HBV-DNA開放閱讀框PreS/S基因分為三個編碼區(qū),編碼PreS1, PreS2和S多聚體。多聚體分別組合成分別LHBs(PreS1+PreS2+S), MHBs(PreS2+S)和 SHBs(S)。 LHBs及MHBst(修飾剪切C末端MHBs蛋白), 兩者統(tǒng)稱PreS2反式轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白家族, 具有調(diào)節(jié)多種細胞、病毒基因轉(zhuǎn)錄水平, 影響細胞增殖活性的作用。研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)PreS/S基因小鼠易誘發(fā)肝臟惡性腫瘤[1,2], 也發(fā)現(xiàn)PreS2調(diào)節(jié)蛋白特異性激活c-Raf-1/MEK/ERK信號通路增加肝細胞增殖[3-8]。因此PreS2調(diào)節(jié)蛋白在肝細胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用成為研究重點。

由于HBV感染具有專一性和特異性, 因此構建人類乙肝病毒感染細胞模型及動物模型較困難[9,10]。本研究首先通過分析Pubmed基因庫HBV基因序列, 設計引物, 用PCR擴增法臨床血液標本中的PreS/S基因, 經(jīng)測序及Pfam蛋白數(shù)據(jù)庫［11］比對分析, PCR 產(chǎn)物表達蛋白屬于C亞型HBV表面抗原蛋白家族, 利用PCR產(chǎn)物構建真核表達質(zhì)粒, 實現(xiàn)PreS/S基因的真核細胞表達。為研究PreS2調(diào)節(jié)蛋白對肝細胞分子信號通路影響及其在肝細胞惡變過程中的作用提供有力工具。

［1］ Hildt E, Munz B, Saher G, et al.The PreS2 activator MHBs(t) of hepatitis B virus activates c-raf-1/Erk2 signaling in transgenic mice.(2002) EMBO J, 21: 525-535.

［2］ Chisari FV, Klopchin K, Moriyama T, Pasquinelli C, Dunsford HA, Sell S, Pinkert CA, Brinster RL and Palmiter RD.Molecular pathogenesis of hepatocellular carcinoma in hepatitis B virus transgenic mice.(1989) Cell, 59:1145-1156.

［3］ V.E.Gurtsevitch.Human Oncogenic Viruses: Hepatitis B and Hepatitis C Viruses and Their Role in Hepatocarcinogenesis.(2008)BIOCHEMISTRY, 73(5):627-639.

［4］ Wei Sun, Fan Zhong, Lianteng Zhi, Gangqiao Zhou, Fuchu He.Systematic-omics analysis of HBV-associated liver diseases. (2009)Cancer Letters, 286: 89-95.

［5］ Tan YJ.Hepatitis B virus infection and the risk of hepatocellular carcinoma.(2011) World J Gastroenterol, 17(44):4853-7.

［6］ Han YF, Zhao J, Ma LY, Yin JH, Chang WJ, Zhang HW, Cao GW.Factors predicting occurrence and prognosis of hepatitis-B-virusrelated hepatocellular carcinoma.(2011) World J Gastroenterol,17(38):4258-70.

［7］ Fallot G, Neuveut C, Buendia MA.Diverse roles of hepatitis B virus in liver cancer. (2012) Curr Opin Virol, 2(4):467-73.

［8］ El-Serag HB.Epidemiology of viral hepatitis and hepatocellular carcinoma.(2012) Gastroenterology, 142(6):1264-1273.

［9］ Long Wu, Zhao-You Tang, Yan Li.Experimental models of hepatocellular carcinoma: developments and evolution.(2009) J Cancer Res Clin Oncol, 135: 969-981.

［10］ Dandri M, Lütgehetmann M, Petersen J.Experimental models and therapeutic approaches for HBV.( 2013) Semin Immunopathol.35(1):7-21.

［11］ R.D.Finn, J.Mistry, J.Tate, P.Coggill, A.Heger, J.E.Pollington,O.L.Gavin, P.Gunesekaran, G.Ceric, K.Forslund, L.Holm, E.L.Sonnhammer, S.R.Eddy, A.The Pfam protein families database:(2010) Bateman Nucleic Acids Research, 38: 211-222.

Construction of protein (EGF)-eukaryotic expression plasmid containing Hepatitis virus PreS/S gene

LIAN Fang, HUANG Chao-yuan, WU Guo-bin.
Department of Physiology, Guangxi Medical University, Nanning,530021, China

Objective To clone HBV PreS/S gene and constructe the PreS / S gene expression plasmid.Methods The PreS/S gene was sequenced correctly cloned from the HBSAg(+) patient DNA by PCR and recombined the eukaryotic expression plasmid.Results The PreS/S gene was confirmed in the eukaryotic expression plasmid by Restriction enzyme digestion and sequence analysis.Conclusion The PreS/S gene expression plasmid can be the tools for research of hepatocarcinogenesis.

Hepatitis B virus; PreS/S gene; Plasmid

教育部博士點專項基金(項目編號：20104503120007)；廣西教育廳科研項目(項目編號：201010LX058)

530021 南寧, 廣西醫(yī)科大學生理教研室(連芳)；廣西醫(yī)科大學2012級碩士研究生(黃超源)；廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院肝膽外科(鄔國斌)

鄔國斌 Email：gb.wu@126.com