動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 竇茂鑫 趙 迪 侯永清 吳 濤

百里香芳香油除能賦予食品香氣以外，還具有防腐和抗氧化的作用（樊明濤和陳錦屏，2002）。百里香芳香油的主要成分是百里香酚和香芹酚，二者的含量總和是衡量百里香芳香油質(zhì)量的重要指標(biāo)（張知俠，2004）。本研究建立了檢測(cè)飼料添加劑百里香油中香芹酚和百里香酚高效液相色譜法。

1 材料與方法

1.1 儀器 高效液相色譜儀（Waters 1525型，配Waters 2489檢測(cè)器）；超聲波清洗器；電子天平（精度 0.0001 g）。

1.2 試劑 甲醇、冰醋酸為色譜純；試驗(yàn)用超純水；香芹酚標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma公司，純度 ≥ 99%）；百里香酚標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma公司，純度 ≥99%）。

1.3 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18（2）柱（粒度為 5 μm，柱規(guī)格為 250 mm×4.5 mm）；流動(dòng)相：甲醇-水-冰醋酸（60∶4∶2，V∶V∶V）；檢測(cè)波長(zhǎng)：274 nm，流速：1.0 mL/min，進(jìn)樣體積為 20 μL；柱溫：30 ℃。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 精密量取香芹酚0.5 mL，置于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，制成香芹酚含量為1%的貯備液；精密稱取百里香酚0.5 g，置于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，制成百里香酚濃度為10 mg/mL的貯備液。然后用甲醇將香芹酚貯備液稀釋成含量 分 別 為 0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.4 μL/mL 的標(biāo)準(zhǔn)液，用甲醇將百里香酚貯備液稀釋成濃度為5.0、10.0、50.0、100.0、250.0 μg/mL 和 500.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。

1.5 樣品溶液的制備 精密量取百里香油樣品0.1 mL置于250 mL容量瓶中，加200 mL甲醇超聲提取30 min，冷卻后用甲醇定容，經(jīng)過(guò)0.22 μm濾膜過(guò)濾后制得供試樣品溶液。

1.6 加樣回收實(shí)驗(yàn) 精密量取5份已知含量的百里香油供試樣品，分別添加已知含量的香芹酚和百里香酚標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定兩者的回收率和精密度。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖 由圖1可見，香芹酚和百里香酚得到了很好的基線分離，峰形對(duì)稱，無(wú)雜質(zhì)峰干擾。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 將百里香酚和香芹酚系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別取20 μL進(jìn)樣，測(cè)定積分值，以峰面積為縱坐標(biāo)，以百里香酚和香芹酚含量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。

百里香酚：Y=10372X+43944，R2=0.9995；

香芹酚：Y=10138X+42475，R2=0.9993；

結(jié)果表明，百里香酚濃度為5～500 μg/mL線性關(guān)系良好，香芹酚濃度為為0.01～0.4 μL/mL也呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.3 精密度實(shí)驗(yàn) 分別取100 μg/mL的百里香酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液和0.1 μL/mL的香芹酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液20 μL進(jìn)樣，連續(xù)進(jìn)樣 5次，測(cè)定峰面積（表 1）。求得百里香酚和香芹酚峰面積的RSD分別為0.64%和0.89%，說(shuō)明此方法具有較好的精密度。

表1 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果（峰面積）

2.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 按1.5中的方法制成的5份百里香油供試樣品中百里香酚和香芹酚含量如表2和表3所示。實(shí)驗(yàn)測(cè)得百里香酚和香芹酚的平均含量分別為22.70%和5.12%，變異系數(shù)分別為0.86%和1.35%，說(shuō)明方法重現(xiàn)性良好。

2.5 加樣回收實(shí)驗(yàn) 精密量取5份已知含量的百里香油供試樣品5 mL，分別置于5個(gè)50 mL容量瓶中，然后分別添加濃度為100 μg/mL百里香酚標(biāo)準(zhǔn)液和0.1 μL/mL香芹酚標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得結(jié)果見表4、表5。從表4和表5可見，百里香酚和香芹酚的平均回收率為98.42%和97.81%，RSD分別為1.18%和0.90%，說(shuō)明該方法回收率高。

3 小結(jié)

本研究建立了飼料添加劑百里香油中香芹酚和百里香酚的檢測(cè)方法。實(shí)驗(yàn)分別采用甲醇、無(wú)水乙醇和95%乙醇超聲提取30 min，結(jié)果表明，無(wú)水乙醇和95%乙醇提取的回收率相仿，略低于甲醇提取的回收率。因此本實(shí)驗(yàn)選用甲醇超聲提取 30 min，采用 Diamonsil C18（2）柱分離，Waters 2489 檢測(cè)器檢測(cè)，以甲醇-水-冰醋酸（60∶4∶2，V∶V∶V）為流動(dòng)相，結(jié)果顯示，此方法香芹酚和百里香酚得到很好的基線分離，且重復(fù)性好、回收率高，可以作為百里香油中香芹酚和百里香酚的檢測(cè)方法。

表2 百里香油中百里香酚含量測(cè)定結(jié)果

表3 百里香油中香芹酚含量測(cè)定結(jié)果

表4 百里香油中百里香酚回收率測(cè)定結(jié)果

表5 百里香油中香芹酚回收率測(cè)定結(jié)果

[1]樊明濤，陳錦屏.百里香芳香油及其主要成分抗氧化試驗(yàn)[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2002，11（1）：34 ～ 36.

[2]張知俠.百里香芳香油化學(xué)成分的研究[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2004，13（3）：151～153.