鄧曉慧, 宋海巖, 孫春莉

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，河南 新鄉(xiāng) 453003)

槲皮素對人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞增殖的影響*

鄧曉慧△, 宋海巖, 孫春莉

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，河南 新鄉(xiāng) 453003)

目的探討槲皮素對人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞增殖抑制和凋亡的影響，為卵巢癌臨床治療提供依據(jù)。方法不同濃度槲皮素處理卵巢癌SKOV-3細(xì)胞后，采用MTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖抑制作用并計(jì)算抑制率，細(xì)胞免疫化學(xué)染色法鑒定細(xì)胞凋亡，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡。結(jié)果槲皮素能夠抑制SKOV-3細(xì)胞的增殖，且呈時(shí)間和劑量依賴性，免疫熒光顯示槲皮素對SKOV-3細(xì)胞具有誘導(dǎo)凋亡作用，流式細(xì)胞術(shù)顯示SKOV-3細(xì)胞被阻滯在S期， G2/M期細(xì)胞比例降低，凋亡率上升。結(jié)論槲皮素在體外能夠抑制卵巢癌SKOV-3細(xì)胞的增殖，阻止細(xì)胞由S期向G2期移行，促進(jìn)其凋亡。

細(xì)胞凋亡； 卵巢腫瘤； 槲皮素

卵巢癌是女性生殖器官常見的腫瘤之一，發(fā)病率僅次于子宮頸癌和子宮體癌而位居第3位，但因卵巢癌死亡率占各類婦科腫瘤的首位[1]，對婦女生命造成嚴(yán)重威脅。目前治療卵巢癌的化療藥物不僅對腫瘤細(xì)胞具有殺傷力，對正常細(xì)胞的副作用也非常大，故尋找有效的化療藥物是當(dāng)務(wù)之急。槲皮素(quercetin,Que)是黃酮類化合物的一種，在自然界廣泛存在于水果、蔬菜以及植物中[2-3]。近年來槲皮素在抑制腫瘤細(xì)胞生長及防止惡性轉(zhuǎn)移方面的研究表明槲皮素有望應(yīng)用到臨床抗腫瘤的治療，它可以通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡或者是通過阻止細(xì)胞周期中某個(gè)環(huán)節(jié)來抑制癌細(xì)胞增殖[4-6]。我們前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)槲皮素對胃癌、食管癌有抑制增殖作用，但是槲皮素對卵巢癌這方面的效果需進(jìn)一步探討，本文通過體外抗瘤實(shí)驗(yàn)為藥物應(yīng)用提供依據(jù)。

材 料 和 方 法

1材料

人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫。Que購于Sigma,用二甲基亞砜(DMSO)溶解后-20 ℃保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋。MTT和DMSO 購于Sigma，Dulbecco’s modified Eagle medium(DMEM)購于Invitrogen，胎牛血清購于武漢博士德生物工程有限公司，細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡試劑盒、細(xì)胞凋亡-Hoechst試劑盒購于碧云天生物技術(shù)研究所。

2方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 卵巢癌SKOV-3細(xì)胞培養(yǎng)于含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，同時(shí)加入1%青霉素和鏈霉素，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度孵育箱中培養(yǎng)。

2.2細(xì)胞抑制率檢測 采用MTT法檢測細(xì)胞活性并計(jì)算細(xì)胞抑制率，將對數(shù)生長期的SKOV-3細(xì)胞置于96孔板中(5×103cells/well)，培養(yǎng)24 h后換液，同時(shí)在培養(yǎng)基中加入濃度不同的槲皮素(0、0.12、0.23、0.47、0.94、1.88、3.725、7.5、15、30 g/L)，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h后，加入MTT(5 g/L)各20 μL，4 h后，吸出培養(yǎng)液每孔加入DMSO 150 μL，振蕩10 min，用酶標(biāo)儀570 nm波長下測吸光度(A)。

2.3細(xì)胞凋亡率檢測 用Annexin V-FITC/PI雙染色法分析槲皮素誘導(dǎo)SKOV-3細(xì)胞凋亡作用，分別收集0、15、30 g/L槲皮素作用24 h后的貼壁細(xì)胞于10 mL離心管中，調(diào)制成單細(xì)胞懸液濃度為1×109cells/L,1 000 r/min 4 ℃離心5 min，棄上清液，PBS洗滌離心后，把細(xì)胞重懸于200 μL孵育緩沖液加入10 μL Annexin V-FITC/PI避光室溫反應(yīng)15 min，加入孵育緩沖液300 μL，用流式細(xì)胞儀檢測。

2.4免疫熒光凋亡鑒定 按照Hoechst試劑盒操作步驟，將細(xì)胞置于6孔板培養(yǎng)24 h，加入槲皮素培養(yǎng)48 h，取出6孔板中的蓋玻片，PBS洗滌后加入0.5 mL固定液固定10 min，PBS洗滌2遍各 3 min，加入0.5 mL Hoechst 33258 染色液，于搖床上染色5 min后PBS 洗滌2遍，每次3 min，抗熒光淬滅封片液封片，熒光顯微鏡下檢測細(xì)胞核,計(jì)算細(xì)胞凋亡率，細(xì)胞凋亡率(%)=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

2.5細(xì)胞周期檢測 取對數(shù)生長期細(xì)胞接種在12孔板中培養(yǎng)24 h，分別加入槲皮素(濃度為30 g/L)和培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后用胰酶消化離心，PBS洗滌制成單細(xì)胞懸液，冰乙醇4 ℃固定過夜，碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色1 h后流式細(xì)胞儀檢測。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組間差異用單因素方差分析(ANOVA)比較，兩組比較用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1槲皮素對SKOV-3細(xì)胞增殖抑制作用

卵巢癌SKOV-3細(xì)胞在含有不同濃度(0.12～30 g/L)槲皮素培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)24 h和48 h后， MTT結(jié)果顯示,細(xì)胞的生長活性明顯降低，增殖受到抑制，相同藥物劑量隨培養(yǎng)時(shí)間延長細(xì)胞活性相應(yīng)降低，槲皮素30 g/L培養(yǎng)48 h后細(xì)胞活性最低，增殖抑制率最高達(dá)58.72%，抑制率呈現(xiàn)劑量、時(shí)間依賴性，見圖1。

Figure 1. Effect of quercetin on the viability of SKOV-3 cells at 24 h and 48 h.Mean±SD.n=6.*P<0.05vs0 g/L;△P<0.05vs24 h.

圖1槲皮素作用24h和48h對SKOV-3細(xì)胞活性的影響

2流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

用Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測槲皮素誘導(dǎo)SKOV-3細(xì)胞凋亡作用，正常細(xì)胞分布于分析圖左下區(qū)，早期凋亡細(xì)胞分布于右下區(qū)，右上區(qū)為晚期凋亡細(xì)胞或死亡細(xì)胞，早、晚期凋亡率的和為總凋亡率。結(jié)果顯示，15 g/L組的總凋亡率為(33.62±1.17)%,明顯高于對照組[(7.13±0.92)%](P<0.01)，30 g/L組的總凋亡率為(69.12±2.97)%，與低劑量組和對照組均有顯著差異(P<0.01)，見圖2。

3細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)結(jié)果

15 g/L組和30 g/L組與對照組相比凋亡數(shù)明顯增多，凋亡率均高于正常對照組，差異顯著(P<0.05),見圖3。

4細(xì)胞周期結(jié)果

SKOV-3細(xì)胞用槲皮素作用48 h后，用流式細(xì)胞術(shù)對細(xì)胞周期進(jìn)行分析，結(jié)果顯示卵巢癌SKOV-3細(xì)胞被槲皮素處理后，細(xì)胞分裂周期中S期細(xì)胞比率明顯增加， G2期細(xì)胞顯著降低，減少至零,見圖4，提示槲皮素主要使細(xì)胞大多停留在S期，導(dǎo)致凋亡。

討 論

生物類黃酮由于其獨(dú)特的生物特性, 近年來人們大量地從蔬菜水果中提取黃酮類化合物，據(jù)報(bào)道黃酮類化合物具有抗氧化、抗菌消炎、抗病毒、抗癌、預(yù)防癌癥等作用[7-8]。近年來由于卵巢癌的高發(fā)病率以及高死亡率，迫切需要尋找一種有效的臨床治療方法。槲皮素為黃酮類的一種，研究發(fā)現(xiàn)它能夠抑制結(jié)腸癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌以及乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[9-11]，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討槲皮素對卵巢癌細(xì)胞的影響，旨在為槲皮素應(yīng)用于卵巢癌的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

Figure 2. Detection of apoptosis of SKOV-3 cells by flow cytometry.Mean±SD.n=6.**P<0.01vs0 g/L;△△P<0.01vs15 g/L.

圖2流式細(xì)胞術(shù)檢測槲皮素對SKOV-3細(xì)胞凋亡的影響

Figure 3. The results of Hoechst 33258 staining(×100).Mean±SD.n=6.▲P<0.05vs0 g/L.

圖3各組細(xì)胞凋亡Hoechst33258染色結(jié)果

Figure 4. Effect of quercetin (0 g/L and 30 g/L) on the cell cycle of SKOV-3 cells.Mean±SD.*P<0.05，**P<0.01vs0 g/L.

圖4槲皮素對SKOV-3細(xì)胞細(xì)胞周期的影響

本實(shí)驗(yàn)通過MTT檢測不同劑量、不同作用時(shí)間的槲皮素對卵巢癌SKOV-3細(xì)胞生長活性的影響，結(jié)果顯示槲皮素對卵巢癌細(xì)胞的生長活性具有抑制作用，其增殖抑制率與作用時(shí)間和劑量呈明顯的相關(guān)性，隨藥物濃度增大，作用時(shí)間的延長，抑制率明顯升高。流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡，SKOV-3細(xì)胞經(jīng)過Annexin V-FITC/PI雙染色，結(jié)果顯示槲皮素對卵巢癌細(xì)胞有誘導(dǎo)凋亡作用，細(xì)胞凋亡率與劑量呈正相關(guān)性。Hoechst染色法在形態(tài)學(xué)上同時(shí)也驗(yàn)證了槲皮素能夠誘導(dǎo)卵巢癌SKOV-3細(xì)胞凋亡。以上結(jié)果表明槲皮素能夠抑制卵巢癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡。

凋亡在細(xì)胞壞死過程中起重要作用，在調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、腫瘤的形成和發(fā)展中起關(guān)鍵作用。本實(shí)驗(yàn)通過流式細(xì)胞術(shù)分析槲皮素抑制卵巢癌SKOV-3細(xì)胞增殖的可能機(jī)制。細(xì)胞周期結(jié)果顯示,槲皮素作用后， S期細(xì)胞明顯增加，G2/M期細(xì)胞相對減少，提示槲皮素主要使卵巢癌SKOV-3細(xì)胞在S期受到阻滯，阻止細(xì)胞向G2/M期移行,從而誘導(dǎo)凋亡，提示細(xì)胞周期阻滯為槲皮素抑制卵巢癌SKOV-3細(xì)胞生長、誘導(dǎo)凋亡的重要機(jī)制之一。

綜上所述，槲皮素對卵巢癌SKOV-3細(xì)胞有抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用，但其詳細(xì)的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步探討研究，本實(shí)驗(yàn)僅僅從體外進(jìn)行檢測，若能在體內(nèi)深入研究及進(jìn)行相關(guān)臨床實(shí)驗(yàn)，明確槲皮素對卵巢癌的作用機(jī)制，有望為卵巢癌的治療方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)也有利于槲皮素相關(guān)新藥的研發(fā)。

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EffectofquercetinonproliferationofhumanovariancancerSKOV-3cells

DENG Xiao-hui, SONG Hai-yan, SUN Chun-li

(DepartmentofHumanAnatomy,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453003,China.E-mail:dengxhhappy@126.com)

AIM: To study the inhibitory effect of quercetin on the proliferation and apoptosis of human ovarian cancer SKOV-3 cells.METHODSSKOV-3 cells were treated with different doses of quercetin. The inhibitory effect of quercetin on the proliferation was detected by MTT assay. The cell apoptosis was determined by immunocytochemistry. The cell cycle and apoptosis were assessed by flow cytometry.RESULTSQuercetin inhibited the proliferation of ovarian cancer SKOV-3 cells in a time- and dose-dependent manner. Quercetin induced apoptosis of SKOV-3 cells. The proportion of S phase and the apoptotic rate were significantly increased, and the proportion of G2/M phase was reduced after treatment with quercetin.CONCLUSIONQuercetin inhibits the growth of ovarian cancer SKOV-3 cellsinvitro, and promotes apoptosis through S phase arrest.

Apoptosis; Ovarian neoplasms; Quercetin

R737.3

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.01.016

1000- 4718(2013)01- 0099- 04

2012- 10- 13

2012- 12- 12

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院高學(xué)歷人才科研啟動項(xiàng)目，2011新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院重點(diǎn)領(lǐng)域招標(biāo)課題(No.ZD2011-38)

△通訊作者 Tel:0373-3029051;E-mail:dengxhhappy@126.com