趙 行， 鄭筱嬌， 高 洲， 沈蓉蓉， 岑 東,△， 裴仁治， 羅建平， 呂建新

(1溫州醫(yī)學(xué)院浙江省醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州 325027； 2溫州醫(yī)學(xué)院附屬樂(lè)清醫(yī)院，樂(lè)清市人民醫(yī)院，浙江 樂(lè)清 325600； 3寧波市鄞州區(qū)疾病預(yù)防控制中心，浙江 寧波 315100； 4寧波市鄞州人民醫(yī)院，浙江 寧波 315040)

HGF基因轉(zhuǎn)染對(duì)裸鼠人淋巴瘤移植瘤的促進(jìn)作用*

趙 行1,2， 鄭筱嬌1， 高 洲1， 沈蓉蓉1， 岑 東1,3△， 裴仁治3， 羅建平4， 呂建新1

(1溫州醫(yī)學(xué)院浙江省醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州 325027；2溫州醫(yī)學(xué)院附屬樂(lè)清醫(yī)院，樂(lè)清市人民醫(yī)院，浙江 樂(lè)清 325600；3寧波市鄞州區(qū)疾病預(yù)防控制中心，浙江 寧波 315100；4寧波市鄞州人民醫(yī)院，浙江 寧波 315040)

目的探討肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)基因轉(zhuǎn)染對(duì)裸鼠人淋巴瘤移植瘤的促進(jìn)作用及其機(jī)制。方法采用HGF基因重組質(zhì)粒pVITRO2-HGF轉(zhuǎn)染的Raji細(xì)胞建立裸鼠皮下人淋巴瘤移植瘤模型，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)裸鼠體重和腫瘤大小；8周后獲取瘤組織，分別采用脫氧核糖核酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記技術(shù)(TUNEL) 和免疫組化檢測(cè)移植瘤組織的細(xì)胞凋亡和微血管密度(MVD)，并進(jìn)行相關(guān)分析。結(jié)果造模成功率為96.7%。HGF轉(zhuǎn)染組的瘤體積明顯大于HGF轉(zhuǎn)染+VP-16組(P<0.01)、未轉(zhuǎn)染組與空載體組(P<0.01)，HGF轉(zhuǎn)染+VP-16組也大于對(duì)照組(P<0.01)，未轉(zhuǎn)染組與空載體組間無(wú)顯著差異(P>0.05)。pVITRO2-HGF轉(zhuǎn)染組凋亡指數(shù)顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，經(jīng)VP-16誘導(dǎo)后凋亡增加(P<0.01)，但仍低于對(duì)照組(P<0.01)。pVITRO2-HGF轉(zhuǎn)染組的MVD顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，但經(jīng)VP-16誘導(dǎo)后血管增生降低(P<0.01)，但仍高于對(duì)照組 (P<0.05)，對(duì)照組間無(wú)顯著差異(P>0.05) 。結(jié)論HGF基因轉(zhuǎn)染可顯著促進(jìn)裸鼠人淋巴瘤移植瘤的生長(zhǎng)，明顯抑制凋亡的發(fā)生，這一效應(yīng)可能與其促進(jìn)腫瘤血管新生和抑制腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)。

肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子； 基因轉(zhuǎn)染； 淋巴瘤； 裸鼠； 異種移植物

肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor，HGF)或稱分散因子(scatter factor，SF)，是一種多功能生長(zhǎng)因子，通過(guò)酪氨酸激酶途徑，具有促進(jìn)肝細(xì)胞、上皮細(xì)胞、造血細(xì)胞等多種類型細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和形態(tài)發(fā)生的作用[1-3]。它還參與多種細(xì)胞的增殖、遷徙，對(duì)各類腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移有著重要的誘導(dǎo)作用，表明其在癌癥中扮演著重要角色。在體外的探索性實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)HGF轉(zhuǎn)染人淋巴瘤Raji細(xì)胞明顯促進(jìn)增殖、遷徙、侵襲以及抗凋亡作用[4-5]。依托泊苷(etoposide,VP-16)是鬼臼毒素的半合成衍生物, 具有廣譜的抗腫瘤活性，近年來(lái)常用于血液系統(tǒng)惡性腫瘤和實(shí)體瘤的治療。在此基礎(chǔ)上，我們擬建立人淋巴瘤Raji細(xì)胞裸鼠移植瘤模型，擬在動(dòng)物水平上觀察研究HGF基因?qū)α馨土錾L(zhǎng)的促進(jìn)作用及其對(duì)VP-16誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡的抑制作用。

材 料 和 方 法

1材料

人淋巴瘤細(xì)胞系Raji細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞所；3周齡雄性BALB/c-nu/nu裸鼠購(gòu)自中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，置SPF條件飼養(yǎng)；轉(zhuǎn)染HGF基因重組質(zhì)粒pVITRO2-HGF和質(zhì)粒pVITRO2的淋巴瘤細(xì)胞已由本室構(gòu)建；蛋白酶K、DAB Kit和MaxVision試劑盒(兔)購(gòu)自福建邁新公司；RPMI-1640購(gòu)自Gibco，新生胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程公司；Vybrant凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Invitrogen；原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Roche；兔抗人CD34單克隆抗體購(gòu)自Epitomics；VP-16購(gòu)自江蘇恒瑞公司；潮霉素B(50 g/L)購(gòu)自Amersco。

2方法

2.1細(xì)胞的常規(guī)靜置培養(yǎng) 于50 mL培養(yǎng)瓶中用5 mL含10% BCS的RPMI-1640培養(yǎng)Raji細(xì)胞，37 ℃、5% CO2常規(guī)靜置培養(yǎng)。待細(xì)胞培養(yǎng)液顏色轉(zhuǎn)黃或細(xì)胞呈巨大團(tuán)狀時(shí)，用吸管輕輕吹打，直至變成單個(gè)細(xì)胞，轉(zhuǎn)移置15 mL一次性離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入2 mL新鮮培養(yǎng)液，混勻，取1 mL混勻液置新培養(yǎng)瓶中，加入4 mL培養(yǎng)液，37 ℃、5% CO2常規(guī)靜置培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞(鏡下細(xì)胞干凈而透亮)進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

2.2人淋巴瘤裸鼠皮下移植瘤模型的建立 構(gòu)建3組模型：以未轉(zhuǎn)染Raji細(xì)胞組和pVITRO2-mcs轉(zhuǎn)染組為對(duì)照組，以HGF轉(zhuǎn)染組為實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組每組5只，實(shí)驗(yàn)組每組10只。分別將處對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期各組細(xì)胞以1 500 r/min，離心5 min，收集，無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌2次，重懸于無(wú)血清RPMI-1640中，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×1010/L，按組皮下接種于10只BALB/c-nu/nu裸鼠左下肢近腹股溝處，每只0.1 mL(5×106個(gè)細(xì)胞)，構(gòu)建裸鼠移植瘤模型。以注射等體積Raji細(xì)胞和轉(zhuǎn)染pVITRO2-mcs Raji細(xì)胞為對(duì)照。處理后常規(guī)飼養(yǎng)，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)各組裸鼠的生存情況和瘤體生長(zhǎng)情況。

2.3VP-16促凋亡處理 建模成功后將實(shí)驗(yàn)組分為2組，每組5只：HGF轉(zhuǎn)染組和HGF轉(zhuǎn)染+VP-16組。經(jīng)尾靜脈注射100 μL VP-16，1.2 mg ·kg-1·d-1(約每只30 μg/d，7 d)，以等體積的PBS(對(duì)照組和HGF轉(zhuǎn)染組)作為對(duì)照。處理后常規(guī)飼養(yǎng)1周。動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)各組裸鼠的生存情況和瘤體生長(zhǎng)情況。

2.4裸鼠體重、腫瘤體積和抑瘤率 接種各組細(xì)胞后每7 d后用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤大小，并用電子稱稱裸鼠體重，連續(xù)觀測(cè)8周后拉頸法處死全部裸鼠，剝離皮下腫瘤，測(cè)量腫瘤長(zhǎng)、短徑。腫瘤體積(volume，V)按公式計(jì)算：V(mm3)=3.14/6×a×b2，其中a為腫瘤的長(zhǎng)徑，b為短徑，單位為毫米(mm)。

2.5細(xì)胞凋亡指數(shù)(apoptotic index,AI)的檢測(cè) 腫瘤組織切片常規(guī)脫蠟，梯度乙醇脫水， 20 mg/L蛋白酶K室溫消化，采用TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡，中性樹(shù)脂封固，鏡下觀察。以細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕褐色反應(yīng)物為陽(yáng)性，每例切片至少計(jì)數(shù)5個(gè)200倍視野，以平均每1 000個(gè)細(xì)胞核中含凋亡細(xì)胞數(shù)作為AI，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。

2.6腫瘤微血管密度(microvessel density,MVD)的檢測(cè) 腫瘤組織切片常規(guī)脫蠟，梯度乙醇脫水，3%H2O2滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，采用CD34(微血管標(biāo)志物)免疫組化染色，中性樹(shù)脂封固，鏡下觀察。每張切片先在低倍鏡下確定5個(gè)血管密度最高區(qū)域，再在高倍鏡(200倍)下進(jìn)行微血管計(jì)數(shù)。記錄5個(gè)區(qū)域視野的微血管數(shù)，取其均值作為該標(biāo)本的MVD，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件行方差齊性檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

結(jié) 果

1HGF對(duì)人淋巴瘤裸鼠模型腫瘤生長(zhǎng)的促進(jìn)作用

皮下注射2周后觀察淋巴瘤裸鼠模型，造模成功率為96.7%。8周后發(fā)現(xiàn)，HGF轉(zhuǎn)染組的瘤體積明顯大于HGF轉(zhuǎn)染+VP-16組(P<0.01)、未轉(zhuǎn)染組與空載體組(P<0.01)，HGF轉(zhuǎn)染+VP-16組也大于對(duì)照組(P<0.01)，未轉(zhuǎn)染組與空載體組間無(wú)顯著差異(P>0.05)，提示HGF可促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，而VP-16則使腫瘤生長(zhǎng)受抑制,見(jiàn)圖1、2和表1。

2細(xì)胞凋亡指數(shù)的檢測(cè)

采用TUNEL法檢測(cè)凋亡指數(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：接種8周后pVITRO2-HGF組凋亡指數(shù)顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，經(jīng)VP-16誘導(dǎo)后凋亡增加(P<0.01)，但仍低于對(duì)照組(P<0.01)，提示HGF基因轉(zhuǎn)染可明顯抑制凋亡的發(fā)生，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖,見(jiàn)圖3和表2。

Figure 1. Effect ofHGFgene transfection on the growth of lymphoma in nude mice.

圖1HGF基因轉(zhuǎn)染對(duì)裸鼠模型淋巴瘤生長(zhǎng)的作用

Figure 2. Growth curves of the transplanted tumors.Mean±SD.n=5.**P<0.01vsRaji or pVITRO2；△△P<0.01vspVITRO2-HGF.

圖2移植瘤的生長(zhǎng)曲線

表1HGF基因轉(zhuǎn)染對(duì)裸鼠模型淋巴瘤生長(zhǎng)的作用

Table 1. Effect ofHGFtransfection on the growth of lymphoma in nude mice (mean±SD.n=5)

GroupMouseweight(g)Tumorvolume(mm3)Raji26.58±1.761598±178pVITRO225.71±1.001588±72pVITRO2-HGF27.20±1.453357±489**pVITRO2-HGF+VP-1626.58±2.212252±52**△△

**P<0.01vsRaji or pVITRO2；△△P<0.01vspVITRO2-HGF.

Figure 3. Effect ofHGFgene transfection on apoptosis of lymphoma in nude mice(TUNEL, ×200). A: negative control; B: positive control; C: non-transfection group; D: pVITRO2-mcs transfection group; E: pVITRO2-mcs-HGFtransfection group; F: pVITRO2-mcs-HGFtransfection+VP-16 group.

圖3HGF基因轉(zhuǎn)染對(duì)淋巴瘤細(xì)胞凋亡的影響

3腫瘤微血管密度的檢測(cè)

采用SP法染色檢測(cè)微血管密度，結(jié)果顯示：接種8周后實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均存在不同程度的血管增生。pVITRO2-HGF組顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，但經(jīng)VP-16誘導(dǎo)后血管增生降低(P<0.01)，但仍高于對(duì)照組(P<0.05)；對(duì)照組間無(wú)顯著差異(P>0.05)，提示HGF促進(jìn)移植瘤的血管新生,見(jiàn)圖4和表2。

Figure 4. Effect ofHGFgene transfection on microvessel density of lymphoma in nude mice (SP, ×200). A: negative control; B: positive control; C: non-transfection group; D: pVITRO2-mcs transfection group; E: tumor pVITRO2-mcs-HGFtransfection group; F: pVITRO2-mcs-HGFtransfection+VP-16 group.

圖4HGF基因轉(zhuǎn)染對(duì)淋巴瘤微血管密度的影響

表2HGF基因轉(zhuǎn)染對(duì)淋巴瘤細(xì)胞凋亡和血管形成的影響

Table 2. Effects ofHGFgene transfection on cell apoptosis and angiogenesis of lymphoma in nude mice(mean±SD.n=5)

GroupApoptoticindexMicrovesseldensityRaji81.75±22.249.00±0.82pVITRO279.75±30.838.75±2.63pVITRO2-HGF 10.40±3.36**28.25±4.35**pVITRO2-HGF+VP-16 46.05±10.94**△△18.75±3.30**△△

**P<0.01vsRaji or pVITRO2;△△P<0.01vspVITRO2-HGF.

討 論

研究表明，HGF與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有密切關(guān)系。HGF可促進(jìn)細(xì)胞的有絲分裂、形態(tài)發(fā)生和遷徙，同時(shí)與血管抑制素具47%的同源性，具有促血管新生效應(yīng)，還具有抑制細(xì)胞凋亡的生物學(xué)效應(yīng)[6-8]，因此，HGF對(duì)于腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著重要的作用。

目前對(duì)細(xì)胞因子促瘤作用的研究策略主要有兩類：探討直接使用蛋白的作用[7]和研究通過(guò)載體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染后表達(dá)的間接作用[9-11]。后者目前為最常采用的，在此基礎(chǔ)上根據(jù)導(dǎo)入目標(biāo)基因的方式主要可分為兩類：直接導(dǎo)入[9-10]和轉(zhuǎn)染后導(dǎo)入[9-11]。前者方法簡(jiǎn)單，不需轉(zhuǎn)染細(xì)胞，可直接進(jìn)行瘤內(nèi)或腹腔內(nèi)注射且可反復(fù)加強(qiáng)，但持續(xù)表達(dá)時(shí)間短。后者的常規(guī)策略是轉(zhuǎn)染相應(yīng)的腫瘤細(xì)胞，然后進(jìn)行體內(nèi)或體外實(shí)驗(yàn)，雖操作較復(fù)雜，但因轉(zhuǎn)入細(xì)胞后可穩(wěn)定、高效表達(dá)，獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也更為理想。

通過(guò)前期工作，我們成功構(gòu)建了HGF基因的真核表達(dá)重組質(zhì)粒，并建立穩(wěn)定表達(dá)轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。經(jīng)細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，HGF顯著促Raji細(xì)胞的增殖、遷徙和侵襲及抑制凋亡[12-13]。在此基礎(chǔ)上，我們欲證實(shí)HGF的體內(nèi)生物學(xué)效應(yīng)，因此建立淋巴瘤裸鼠移植瘤模型是關(guān)鍵。然而，目前未見(jiàn)合適的淋巴瘤裸鼠移植瘤造模方法的相關(guān)報(bào)道，也并無(wú)可供直接借鑒的資料。查閱相關(guān)文獻(xiàn)，在常規(guī)造模方法的基礎(chǔ)上，我們?cè)O(shè)計(jì)2種方法：鑒于淋巴瘤為惡性血液系統(tǒng)腫瘤，通過(guò)尾靜脈注射方式造模；采用實(shí)體瘤常規(guī)造方式，采用皮下或皮內(nèi)注射方式造模。經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用直接皮下注射，形成的瘤位置固定、成瘤時(shí)間短、造模成功率高，較尾靜脈注射方式好。因此，我們選擇皮下注射造模方式，并優(yōu)化淋巴瘤細(xì)胞的活性、輸注量、輸注部位、輸注方式、裸鼠品種、飼養(yǎng)條件等實(shí)驗(yàn)因素，造模成功率達(dá)96.7%，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行提供了保障。

觀察裸鼠模型中瘤組織生長(zhǎng)發(fā)現(xiàn)，HGF基因轉(zhuǎn)染明顯促進(jìn)瘤組織的生長(zhǎng)，并拮抗VP-16對(duì)腫瘤組織的抑制。TUNEL法證實(shí)，HGF可明顯改善凋亡誘導(dǎo)劑對(duì)DNA的損傷(P<0.05)，較未經(jīng)誘導(dǎo)劑處理，凋亡指數(shù)顯著降低，提示HGF基因轉(zhuǎn)染可明顯抑制腫瘤細(xì)胞凋亡的發(fā)生，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。與此同時(shí)，觀察瘤組織內(nèi)微血管密度，HGF明顯促進(jìn)血管新生。因此，我們認(rèn)為，HGF可經(jīng)抑制Raji細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，促進(jìn)淋巴瘤生長(zhǎng)，其機(jī)制需進(jìn)一步研究。

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EffectofHGFgenetransfectiononhumanlymphomaxenograftsinnudemice

ZHAO Hang1, 2, ZHENG Xiao-jiao1, GAO Zhou1, SHEN Rong-rong1, CEN Dong1, 3, PEI Ren-zhi3, LUO Jian-ping4, Lü Jian-xin1

(1ZhejiangProvincialKeyLaboratoryofMedicalGenetics,WenzhouMedicalCollege,Wenzhou325027,China;2AffiliatedYueqingHospitalofWenzhouMedicalCollege,YueqingMunicipalHospital,Yueqing325600,China;3YinzhouDistrictCentreforDiseaseControlandPrevention,Ningbo315100,China;4YinzhouPeople’sHospital,Ningbo315040,China.E-mail:cendong2002@163.com)

AIM: To explore the promotion effect of hepatocyte growth factor (HGF) gene transfection on human lymphoma xenografts in nude mice.METHODSThe model of human lymphoma xenograft in nude mice was established by transplantation of Raji cells, which were transfected with recombinant plasmid pVITRO2-HGFharboring theHGFgene. The body weight of the nude mice and the tumor size were dynamically monitored and the tumor tissues were obtained after 8 weeks. Additionally, the methods of terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated nick end labeling (TUNEL) and immunohistochemistry were used to detect the apoptotic index (AI) and microvessel density (MVD).RESULTSThe success rate of the human lymphoma xenografts in nude mice was 96.7%. The tumor volume inHGFtransfection group was significantly greater than that inHGFtransfection+VP-16 group and control groups (non-transfection group and empty vector group). The tumor volume inHGFtransfection+VP-16 group was also bigger than that in control groups. No difference of the tumor volume between non-transfection group and empty vector group was observed. AI inHGFtransfection group was substantially lower than that in control groups. AI inHGFtransfection+VP-16 group showed a little higher than that inHGFtransfection group, yet was still lower than that in control groups. MVD inHGFtransfection group was extraordinary higher than that in control groups, but decreased after VP-16 induction (P<0.01), which was still higher than that in control groups.CONCLUSIONHGFgene transfection significantly promotes the growth of human lymphoma xenografts in nude mice and substantially inhibits the apoptosis presumably owing to promoting tumor angiogenesis and inhibiting tumor cell apoptosis.

Hepatocyte growth factor; Gene transfection; Lymphoma; Nude mice; Xenograft

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2013.01.013

1000- 4718(2013)01- 0081- 05

2012- 06- 27

2012- 11- 13

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技項(xiàng)目(No.2007A175);寧波市科技計(jì)劃(No. 2007C10065;No. 2010A610031)

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