徐 珞， 郭菲菲， 孫向榮， 高勝利， 公衍玲， 邱貝貝

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室,山東 青島 266021)

Ghrelin對糖尿病大鼠下丘腦弓狀核胃牽張敏感神經(jīng)元放電活動及胃運動的調(diào)控*

徐 珞△， 郭菲菲， 孫向榮， 高勝利， 公衍玲， 邱貝貝

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室,山東 青島 266021)

目的觀察鏈脲佐菌素(STZ)所致糖尿病(DM)大鼠下丘腦弓狀核(Arc)胃牽張(GD)敏感神經(jīng)元放電活動及胃運動改變，探討ghrelin對DM大鼠下丘腦Arc GD敏感神經(jīng)元放電活動和胃運動的影響。方法采用STZ腹腔注射誘導(dǎo)DM大鼠模型；通過細胞外記錄神經(jīng)元單位放電和在體胃運動方法，觀察ghrelin及其受體阻斷劑[D-Lys3]-GHRP-6對DM大鼠下丘腦Arc GD敏感神經(jīng)元自發(fā)放電活動和胃運動的影響；應(yīng)用real-time PCR和熒光免疫組化方法，探討DM大鼠Arc內(nèi)ghrelin受體(GHS-R1a)mRNA及其免疫陽性物的表達。結(jié)果在正常大鼠Arc記錄到的98個GD敏感神經(jīng)元中，64.3%為GD興奮性(GD-E)神經(jīng)元，35.7%為GD抑制性(GD-I)神經(jīng)元。在63個GD-E神經(jīng)元中，Arc微量注射ghrelin可使其中73.0%神經(jīng)元興奮，其放電頻率與生理鹽水組比較顯著增加(P<0.05)；而在35個GD-I神經(jīng)元中，Arc微量注射ghrelin可抑制其中60.0%神經(jīng)元，放電頻率顯著降低(P<0.01)；ghrelin改變GD神經(jīng)元放電效應(yīng)可被ghrelin 受體阻斷劑[D-Lys3]-GHRP-6阻斷(P<0.05)；在DM大鼠，Arc記錄到的66個GD敏感神經(jīng)元中有56.1%為GD-E神經(jīng)元，43.9%為GD-I神經(jīng)元。Arc注射ghrelin可興奮其中35.1%GD-E神經(jīng)元，放電頻率與生理鹽水比較顯著增加(P<0.05)；而在29個GD-I神經(jīng)元中，ghrelin可抑制其中21個神經(jīng)元(72.4%)，放電頻率顯著降低(P<0.01)。與正常大鼠比較，DM大鼠Arc GD敏感神經(jīng)元中的GD-E和GD-I比例無顯著改變(P>0.05)，但ghrelin使GD-E神經(jīng)元興奮的比率明顯降低(P<0.05)，放電頻率平均增加率也顯著下降(P<0.05)；但ghrelin使GD-I 神經(jīng)元抑制比率和放電頻率平均減少率均無顯著改變(P>0.05)。在體胃運動研究結(jié)果顯示，Arc微量注射ghrelin，可顯著促進正常和DM大鼠胃運動，且呈顯著量效關(guān)系(P<0.05,P<0.01)，但ghrelin對正常大鼠的促胃運動作用顯著強于其對DM大鼠的作用(P<0.05)，[D-Lys3]-GHRP-6可完全阻斷ghrelin該作用。Real-time PCR研究結(jié)果顯示，DM大鼠下丘腦Arc GHS-R1a mRNA表達較正常大鼠明顯減少(P<0.05)；免疫熒光研究進一步證實DM大鼠下丘腦Arc GHS-R1a 免疫陽性物表達較正常大鼠明顯減少(P<0.05)。結(jié)論下丘腦Arc ghrelin參與DM大鼠GD敏感神經(jīng)元自發(fā)放電活動，并參與胃運動的調(diào)控，該效應(yīng)可能是通過作用于ghrelin受體而實現(xiàn)的。

弓狀核； 糖尿??； Ghrelin； 胃牽張敏感神經(jīng)元； 胃運動； 大鼠

糖尿病(diabetes mellitus, DM)是由多種病因引起的以慢性高血糖為特征的代謝紊亂性疾病，已成為僅次于腫瘤、心腦血管疾病的嚴重威脅人類健康的世界第三大疾病。糖尿病胃輕癱(diabetic gastro-paresis，DGP)是糖尿病并發(fā)癥，近年來發(fā)病率逐年提高。研究資料顯示，大約50%以上的糖尿病患者伴有胃輕癱[1]。糖尿病胃排空障礙，發(fā)病機制十分復(fù)雜，目前尚未完全闡明，傳統(tǒng)學(xué)說認為與多種因素有關(guān)，如高血糖及其導(dǎo)致的自主神經(jīng)病變因素、飲食結(jié)構(gòu)、遺傳因素、肥胖因素等[1]。以往對糖尿病胃輕癱的研究工作多集中在外周，如胃腸激素分泌異常、胃腸平滑肌變性、微血管病變等，近來中樞機制調(diào)控研究倍受關(guān)注。

Ghrelin是近年來發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性生長激素促泌受體(growth hormone secretagogue receptor，GHS-R)的天然配體。1999年Kojima等[2]首次在大鼠及人的胃中分離了這一多肽。因其在促進生長素分泌，調(diào)節(jié)能量代謝過程和胃腸功能等多方面的重要作用[3]，已成為當今研究熱點之一。下丘腦是調(diào)控能量平衡的整合中樞[4]，免疫組化研究顯示，ghrelin在中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要分布于下丘腦弓狀核(arcuate nucleus，Arc)[5]，參與攝食及能量平衡調(diào)控[6]。本研究擬采用單神經(jīng)元細胞外放電記錄以及在體胃運動研究方法，觀察ghrelin在Arc調(diào)控糖尿病大鼠胃的傳入沖動以及對胃運動的影響，為ghrelin在能量代謝方面的作用提供新的理論和實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

1動物及分組

實驗采用健康成年雄性Wistar大鼠(由青島市藥檢所提供)245只，體重250～350 g，置于室溫25 ℃±2 ℃，12 h/12 h晝夜循環(huán)光照條件下生活，自由攝食、飲水。其中121只采用鏈脲佐霉素(streptozotocin，STZ)腹腔注射制作糖尿病大鼠模型，實驗結(jié)束，糖尿病大鼠共有98只，其中53只用于觀察細胞放電活動，35只用于觀察胃運動改變，10只用于觀察Arc ghrelin 及其mRNA表達。

2主要儀器及藥品

MEZ8201型微電極放大器、VC-Ⅱ型雙道記憶示波器和QC-111J型直方圖分析儀均由日本光電公司生產(chǎn)。STZ和硫酸仲丁巴比妥購自Sigma。兔抗GHS-R1a多克隆抗體購自Chemicon；ghrelin購自American Peptide Company；GHS-R拮抗劑[D-Lys3]-GHRP-6由Anaspec提供。GHS-R1a引物(上游引物5’-GAGCCTAACGTCACGTTG-3’，下游引物5’-AGGCAGAAGACCGGTAGA-3’)和內(nèi)參照β-actin 引物(上游引物5’-CTGCCGCATCCTCTrCCTC-3’，下游引物5’-CTCCTGCITGCTGATCCACAT-3’)由BenGCG軟件設(shè)計和Gibco合成。

3糖尿病大鼠模型

健康9周齡雄性Wistar大鼠121只，體重250～350 g，置于室溫25 ℃左右，12/12 h晝夜循環(huán)光照條件下生活，自由飲水。所有動物實驗均符合《青島大學(xué)實驗動物保護和使用管理辦法》。

參照Kirchner等[6]方法制作糖尿病病理模型。造模前先更換籠具，禁食(不禁水)12 h；造模組動物腹腔注射新鮮配制1% STZ液，注射劑量為35 mg/kg，第8 d再行第2次腹腔注射同等劑量1%STZ液，以注射相應(yīng)劑量的0.1 mol/L檸檬酸緩沖液(1 mL/只)為對照組。各組大鼠尾尖采血測空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG), 篩選出FBG<16.7 mmol/L，同時伴有腹部脹大、體重減輕等胃輕癱癥狀的大鼠98只。

4電生理實驗

4.1動物手術(shù) 大鼠用硫酸仲丁巴比妥(100～150 mg/kg)經(jīng)腹腔注射麻醉，頸部正中縱行切口，行氣管插管術(shù)。胃部手術(shù)：腹部正中作縱行切口，經(jīng)胃底部切口將胃內(nèi)容物掏出，以溫和生理鹽水清洗。置入一個薄軟膠氣囊，經(jīng)聚乙烯軟管連至一個5 mL注射器，實驗中注入生理鹽水(3～5 mL,0.5 mL/s, 37 ℃)擴張胃，用以鑒別胃牽張敏感神經(jīng)元，,縫合腹部。頭部手術(shù)：頭部正中切口，牙科鉆顱骨鉆孔，插入三管玻璃微電極至下丘腦Arc，定位參照Pa-xinos-Watson大鼠腦圖譜(前囟后3.20 mm, LR: 0.40 mm, H: 9.80 mm)，覆蓋2%瓊脂生理鹽水與顱骨表面平齊，以保護腦皮層及作為顱骨表面定位標志；作小腦延髓池穿刺術(shù)引流以減少腦波動對微電極位置的影響。

4.2細胞外電記錄 采用三管玻璃微電極 (尖端直徑3～10 μm，阻抗5～15 MΩ)，其中一管為記錄電極，內(nèi)充灌2.0%滂胺天藍，另外兩管分別充以1.5×10-8mol/L ghrelin、2.8×10-8mol/L [D-Lys3]-GHRP-6或生理鹽水(NS)。通過監(jiān)聽器判斷電極尖端進入空氣與瓊脂界面，用液壓推進操縱器將微電極送至Arc區(qū)域內(nèi)，鑒別胃牽張(gastric distension,GD)敏感神經(jīng)元，以神經(jīng)元放電頻率的變化率超過20%作為神經(jīng)元興奮或抑制指標，神經(jīng)元表現(xiàn)興奮的確定為胃牽張興奮型(GD-E)神經(jīng)元，表現(xiàn)為抑制的確定為胃牽張抑制型(GD-I)神經(jīng)元。觀察細胞電信號與噪聲比在3∶1以上,進行細胞外放電記錄。信號經(jīng)MEZ-8201型微電極放大器輸入VC-11雙道示波器，經(jīng)SUMP-PC生物信號處理系統(tǒng)進行放電頻率分析，并繪出序列密度直方圖。

4.3組織學(xué)檢查 每次實驗結(jié)束后，微電泳滂胺天藍入腦組織，以標記微電極所在位置；大鼠經(jīng)心灌注固定，快速斷頭取腦，冰凍切片(50 μm)，中性紅染色，檢查電極記錄位置，位置不準確的資料不列入統(tǒng)計。

5胃運動記錄

5.1下丘腦Arc埋置套管 術(shù)前動物禁食15～20 h，80 g/L水合氯醛(30 mg/kg)腹腔麻醉。參照Pa-xinos-Watson大鼠腦圖譜，將自制不銹鋼套管置入右側(cè)Arc (AP: 2.12～4.30 mm, LR: 0.20～0.50 mm, H: 9.80～10.30 mm)，將一小螺絲釘固定于顱骨表面，用502膠和自凝牙托粉固定套管，并置入不銹鋼內(nèi)芯防止阻塞。實驗結(jié)束后，經(jīng)套管注射1 μL滂胺天藍，灌注固定，斷頭取腦，50 μm系列冠狀切片，對照圖譜觀察套管尖端的定位，位置不準確者不計入統(tǒng)計。

5.2應(yīng)力傳感器(應(yīng)變片)植入術(shù) 術(shù)前動物禁食15～20 h，硫酸仲丁巴比妥腹腔注射麻醉(100～150 mg/kg)。距幽門十二指腸連接處0.5 cm，將記錄胃平滑肌收縮運動的應(yīng)力傳感器縫貼于胃竇漿膜面，導(dǎo)線經(jīng)皮下隧道引至頸后，穿出體外。術(shù)后2 d待動物恢復(fù)正常飲食，無任何疼痛和應(yīng)激反應(yīng)，即可進行實驗。

5.3胃運動記錄 動物禁食15～20 h，自由飲水。實驗時，將大鼠置于特制鼠籠內(nèi)適應(yīng)環(huán)境1 h。用RM-46胃運動記錄儀連續(xù)描記胃運動曲線。以注射前測定胃運動幅度或頻率值為正常值，注射后不同時點觀察胃運動幅度和頻率的變化。

6Real-timePCR

6.1總RNA的提取和單鏈cDNA(ss-cDNA)的合成 糖尿病和正常大鼠各5只，20%烏拉坦(1 g/kg)經(jīng)腹腔麻醉，快速斷頭取腦，冰凍切片(200 μm)，顯微鏡下參照Paxinos-Watson大鼠腦圖譜Arc定位及毛細管打孔取樣，迅速加入1 mL 冰冷Trizol勻漿。用Trizol reagent常規(guī)方法提取總RNA，紫外分光光度計測A值，A260/280比值為1.9～2.2。取總RNA 3 μL(1 g/L)，引物 Oligo-(dT)161 μL(10 nmol/L)，10×RT緩沖液2 μL，dNTPs 2.5 mmol/L 4 μL，RNase抑制劑1 μL，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶 1 μL，至反應(yīng)總體積為20 μL。反應(yīng)條件：42 ℃ 1 h；95 ℃ 5 min。

6.2Real-time PCR 取1 μL ss-cDNA 產(chǎn)物作為待測樣本。所有的待測樣本均一式兩份, 分別對GHS-R1a和看家基因β-actin進行擴增, 擴增反應(yīng)用SYBR Green I定量PCR試劑盒(TaKaRa)和5700型定量PCR儀完成。擴增條件：94 ℃ 1 min； 94℃ 30 s，53 ℃ 15 s, 72 ℃ 15 s, 40個循環(huán)。 隨之觀察該PCR產(chǎn)物的熔解曲線(94 ℃ 0 s，55 ℃ 15 s,94 ℃ 0 s；溫度變化速度為0.1 ℃/s)，并由電腦自動分析系統(tǒng)進行定量分析。以不含ss-cDNA 模板的PCR 反應(yīng)體系設(shè)為陰性對照。

7熒光免疫組化研究

糖尿病和正常大鼠各5只，20%烏拉坦(1 g/kg)經(jīng)腹腔麻醉，灌注固定，斷頭取腦，顯微鏡下參照Paxinos-Watson大鼠腦圖譜行冰凍切片(20 μm)。切片經(jīng)4%正常羊血清/0.5% Triton X-100/PBS孵育2 h，與兔抗GHS-R1a(1∶300稀釋)抗體孵育，4 ℃過夜。加入異硫氰酸熒光素(FITC)交聯(lián)的羊抗兔IgG(1∶50稀釋)，置于黑暗濕盒內(nèi)孵育2 h(避光)，0.01 mol/L PBS沖洗，甘油/PBS封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察免疫陽性細胞。以正常羊血清代替Ⅰ抗為陰性對照，其它步驟同前。

8統(tǒng)計學(xué)處理

計量資料均用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。各組神經(jīng)元放電活動以配對t檢驗進行同一細胞給藥前后放電頻率差別比較，兩組或多組實驗數(shù)據(jù)用非配對t檢驗和One-way ANOVA；real-time PCR結(jié)果分析采用ΔCt值表示[8][檢測待測基因cDNA進入PCR指數(shù)增長期的起始點即循環(huán)閾值(cycle thres-hold, Ct)],以同一樣本中GHS-R1a和看家基因β-actin之間的Ct差值(即ΔCt=CtGHS-R1a- Ctβ-actin)進行組間資料的t檢驗(Prism 3.0 統(tǒng)計軟件)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1Ghrelin對正常大鼠下丘腦Arc內(nèi)GD敏感神經(jīng)元放電活動的影響

在79只正常大鼠Arc記錄到98個神經(jīng)元單位放電，胃擴張刺激可興奮其中的63個神經(jīng)元 (63/98, 64.3%)，神經(jīng)元的平均放電頻率由(2.15±0.33) Hz增加至(3.71±0.54) Hz (P<0.01)，鑒定為GD-E神經(jīng)元；另外有35個神經(jīng)元對GD刺激表現(xiàn)為抑制反應(yīng)(35/98, 35.7%)，神經(jīng)元的平均放電頻率由(1.24±0.19)Hz下降至(0.52±0.14)Hz (P<0.01)，鑒定為GD-I神經(jīng)元。

在63個GD-E神經(jīng)元中，微量注射ghrelin可興奮其中46個神經(jīng)元(46/63, 73.0%)，放電頻率由(2.13±0.46) Hz增加至(2.71±0.54) Hz(P<0.01)，平均增加27.2%±5.8%，與生理鹽水(NS)組相比其放電頻率顯著增加(18.2%±6.1%，P<0.05)；另外有14個神經(jīng)元的放電頻率無明顯變化，有3個神經(jīng)元在給予ghrelin后出現(xiàn)抑制反應(yīng)。GD-E神經(jīng)元給予ghrelin受體阻斷劑[D-Lys3]-GHRP-6和ghrelin混合液后, 其興奮反應(yīng)不再出現(xiàn)。

在35個GD-I神經(jīng)元中，Arc微量注射ghrelin可抑制其中21個神經(jīng)元(21/35，60.0%)，放電頻率由(1.41±0.40) Hz下降至(0.92±0.29) Hz，平均減少53.3%±8.9%(P<0.01)與NS組相比(16.5%±4.1%)差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；另外有11個神經(jīng)元的放電頻率無明顯變化，有3個神經(jīng)元出現(xiàn)興奮反應(yīng)。同樣，GD-I神經(jīng)元給予ghrelin受體阻斷劑[D-Lys3]-GHRP-6和ghrelin混合液后, 其抑制效應(yīng)不再出現(xiàn)。

2Ghrelin對糖尿病大鼠下丘腦Arc內(nèi)GD敏感神經(jīng)元放電活動的影響

在53只糖尿病大鼠Arc記錄到66個神經(jīng)元單位放電，胃擴張刺激可興奮其中的37個神經(jīng)元 (37/66, 56.1%)，神經(jīng)元的平均放電頻率由(2.31±0.78) Hz增加至(3.92±1.02) Hz (P<0.01)； 另外有29個神經(jīng)元對GD刺激表現(xiàn)為抑制反應(yīng)(29/66, 43.9%)，神經(jīng)元的平均放電頻率由(1.33±0.41)Hz下降至(0.61±0.23)Hz (P<0.01)。與正常大鼠比較，糖尿病大鼠Arc內(nèi)GD-E和GD-I神經(jīng)元的放電頻率，以及GD-E和GD-I神經(jīng)元在總GD敏感神經(jīng)元中所占比例均無顯著差異(P>0.05)。

Arc微量注射ghrelin，可使35.1%的GD-E神經(jīng)元興奮(13/37)，放電頻率由(1.98±0.35)Hz增加至(2.45±0.61) Hz(P<0.05)，平均增加23.7%±4.3%，與NS組(11.1%±3.0%)相比差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。給予ghrelin受體阻斷劑[D-Lys3]-GHRP-6和ghrelin混合液, ghrelin的興奮反應(yīng)不再出現(xiàn),見圖1A。與正常大鼠比較，ghrelin使DM大鼠GD-E神經(jīng)元興奮的比率明顯降低(35.1%vs73.0%，P<0.05)，放電頻率平均增加率也顯著下降(23.7%±4.3%vs27.2%±5.8%，P<0.05)。

在29個GD-I神經(jīng)元中，Arc微量注射ghrelin可使72.4%的GD-I神經(jīng)元抑制(21/29)，放電頻率由(1.26±0.42) Hz下降至(0.82±0.29) Hz，平均減少53.7%±8.7%(P<0.01),與NS組(4.7%±1.1%)相比差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；給予ghrelin受體阻斷劑[D-Lys3]-GHRP-6和ghrelin混合液, ghrelin抑制反應(yīng)不再出現(xiàn),見圖1B。但與正常大鼠比較，ghrelin使DM大鼠GD-I 神經(jīng)元抑制比率(72.4%vs60.0%，P>0.05)和放電頻率減少率均無顯著改變(53.7%±8.7%vs53.3%±8.9%，P>0.05)。

Figure 1. Effects of ghrelin on firing activity of gastric distension (GD)-sensitive neurons in arcuate nucleus of hypothalamus in diabetes rats.A:GD-excitatory neurons;B:GD-inhibitory neurons.

圖1Ghrelin對糖尿病大鼠Arc胃牽張敏感神經(jīng)元放電活動的影響

3弓狀核注射ghrelin對糖尿病大鼠胃運動的影響

在體胃運動研究結(jié)果顯示，與正常大鼠比較，糖尿病大鼠胃運動明顯減弱，表現(xiàn)為胃運動幅度[(8.14±1.58)g/minvs(2.21±0.89)g/min，P<0.05]和頻率[(5.18±0.61) Hzvs(1.81±0.23) Hz，P<0.05]顯著降低,見圖2、3。

正常大鼠下丘腦Arc微量注射不同劑量ghrelin(0.05 nmol和0.5 nmol)，胃運動幅度在注射后3 min已有增加，13 min時變化最為明顯，與NS組[(8.01±1.77) g]比較有顯著差異[(14.60±2.20)g，P<0.05；(22.28±4.10)g，P<0.01]，且呈顯著量效依賴關(guān)系；Arc分別注射0.05和0.5 nmol ghrelin，與NS組[(1.81±0.23)Hz]比較，13 min時胃運動頻率也顯著加快[(7.45±0.87)Hz，P<0.05；(10.98±1.03)Hz，P<0.01], 且呈顯著量效依賴關(guān)系。給予ghrelin受體阻斷劑[D-Lys3]-GHRP-6和ghrelin混合液, 胃運動加強作用不再出現(xiàn)(P>0.05)，見圖3。

在DM大鼠，下丘腦Arc微量注射0.05 nmol ghrelin，胃運動幅度和頻率有增加趨勢，但與NS組相比無顯著差異(P>0.05)； 而注射0.5 nmol ghrelin，大鼠胃運動顯著增強，表現(xiàn)為胃運動幅度明顯增加(P<0.05)，收縮頻率明顯加快(P<0.05)。而給予 [D-Lys-3]-GHRP-6和ghrelin混合液, 胃運動幅度和頻率增加作用消失(P>0.05),見圖3。

4糖尿病大鼠下丘腦ArcGHS-R1a表達

熒光免疫組化研究顯示，在正常和DM大鼠下丘腦Arc中均有GHS-R1a免疫陽性細胞表達，但DM大鼠Arc GHS-R1a表達明顯降低[(10.0±2.1)/mm2vs(3.0±0.70)/mm2,P<0.05]。

Real-time PCR研究結(jié)果顯示，糖尿病大鼠下丘腦Arc GHS-R1a mRNA表達較正常對照組大鼠明顯減少，表現(xiàn)為達循環(huán)閾值的循環(huán)次數(shù)明顯增加(9.22±2.45vs14.11±4.01，P<0.05)，見圖4。

討 論

隨著經(jīng)濟社會的發(fā)展，人們的飲食結(jié)構(gòu)、生活方式等發(fā)生了很大改變，糖尿病發(fā)病率顯著上升，尤其II型糖尿病(T2DM)占了較高比例(占糖尿病發(fā)病率的90%～95%)[7]。T2DM是因人體胰島素分泌相對不足或靶細胞對胰島素敏感性降低繼而引發(fā)糖、蛋白質(zhì)、脂肪和水電解質(zhì)等代謝紊亂所導(dǎo)致的疾病，并伴有多種并發(fā)癥，如胃腸運動障礙[8-9]、神經(jīng)變性等[10]。

糖尿病胃運動功能障礙是糖尿病常見的一種慢性并發(fā)癥，10年以上患者胃神經(jīng)肌肉功能異常發(fā)生率高達30%～50%[8]，其主要特點是胃動力下降、排空遲緩，從而導(dǎo)致胃潴留。糖尿病胃動力障礙的發(fā)病機制目前仍不十分清楚，目前認為可能與神經(jīng)病變、平滑肌變性、高血糖等因素有關(guān)[10-12]。

Ghrelin最初在大鼠胃中被發(fā)現(xiàn)，是GHS-R的內(nèi)源性配體[2]。現(xiàn)有報道，ghrelin僅為GHS-R1a的天然配體[12]。Ghrelin可由中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周組織釋放。免疫組化研究顯示，ghrelin樣免疫活性神經(jīng)元在中樞系統(tǒng)主要分布于攝食相關(guān)腦區(qū),尤其是在下丘腦[4-5,13-15]，如弓狀核、背內(nèi)側(cè)核(DMH)、腹內(nèi)側(cè)(VMH)、外側(cè)下丘腦(LH)和室旁核(PVN),在垂體、腦干、小腦及紋狀體中也有分布[16]。Ghrelin主要參與胃運動的調(diào)控，而且與能量代謝密切相關(guān)[17]。近年有文獻報道，ghrelin與GHS-R在人及鼠胰腺中也有表達[18]，可能與胰腺內(nèi)分泌功能密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，ghrelin可促進下丘腦Arc胃牽張敏感神經(jīng)元放電活動和胃運動，該作用可被ghrelin受體特異性阻斷劑[D-Lys3]-GHRP-6消褪，提示Arc ghrelin可能參與胃腸傳入沖動信號的調(diào)控，并通過下行調(diào)控胃腸運動，該作用可能是通過激活其受體而實現(xiàn)的。同時本研究發(fā)現(xiàn)，與正常大鼠比較，糖尿病大鼠Arc內(nèi)GD-E和GD-I神經(jīng)元的放電頻率，以及GD-E和GD-I神經(jīng)元在總GD神經(jīng)元中所占比例無顯著差異，但糖尿病大鼠ghrelin促Arc胃牽張反應(yīng)神經(jīng)元放電作用較正常大鼠明顯減弱，表現(xiàn)為ghrelin使GD-E神經(jīng)元興奮的比率明顯降低，放電頻率平均增加率也顯著減少；且ghrelin促進胃運動作用明顯低于正常大鼠，提示，糖尿病胃運動障礙可能與下丘腦Arc內(nèi)ghrelin能神經(jīng)元功能活動降低有關(guān)。

Figure 2. Effects of ghrelin injected in arcuate nucleus of hypothalamus on gastric motility.A～C:normal rats;D～F: diabetic rats.

圖2下丘腦Arc微量注射ghrelin對胃運動的影響

Figure 3. Effects of ghrelin injected in arcuate nucleus of hypothalamus on the amplitude (A) and frequency (B) of gastric motility.

圖3下丘腦Arc微量注射ghrelin對胃運動幅度和頻率變化的影響

Figure 4. The expression of GHS-R1a mRNA in arcuate nucleus of hypothalamus.

圖4下丘腦ArcGHS-R1amRNA表達

有文獻報道，ghrelin與胰島素間存在明顯負相關(guān)，胰島素在ghrelin的合成中有抑制作用[19-20]。在健康志愿者中可觀察到，當胰島素<600 ppmol時，胰島素的上升對ghrelin沒有影響，但當>600 ppmol時，無論是否伴有高血糖，均可觀察到胰島素上升可使循環(huán)ghrelin的濃度下降。本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠下丘腦Arc ghrelin受體及其mRNA表達較正常大鼠均明顯減少,提示糖尿病大鼠胃腸運動障礙可能也與ghrelin受體表達減少有關(guān)。但ghrelin在糖尿病大鼠Arc作用的減弱機制還有待于進一步深入探討。

[1] Abrahamsson H. Gastrointestinal motility disorders in patients with diabetes mellitus[J]. J Intern Med, 1995,237(4):403-409.

[2] Kojima M, Hosoda H, Date Y. Ghrelin is a growth-hormone-releasing acylated peptide from stomach[J]. Nature, 1999,402(6762):656-660.

[3] Sato T, Nakamura Y, Shiimura Y, et al. Structure, regulation and function of ghrelin[J]. J Biochem, 2012,151(2):119-128.

[4] 趙玉紅，吳麗霞，關(guān) 心，等. 營養(yǎng)性肥胖大鼠的脂代謝紊亂與下丘腦中增食欲素A的表達分析[J].中國病理生理雜志,2011,27(5)：1000-1002.

[5] Guan JL, Wang QP, Kageyama H, et al. Synaptic interactions between ghrelin- and neuropeptide Y-containing neurons in the rat arcuate nucleus[J]. Peptides, 2003,24(12):1921-1928.

[6] Kirchner H, Heppner KM, Tsch?p MH. The role of ghrelin in the control of energy balance[J]. Handb Exp Pharmacol, 2012,209:161-184.

[7] Jendle J, Martin SA, Milicevic Z. Insulin and GLP-1 analog combinations in type 2 diabetes mellitus: a critical review[J]. Expert Opin Investig Drugs, 2012,21(10):1463-1474.

[8] Hu W, Feng P. Myosin light chain kinase is involved in the mechanism of gastrointestinal dysfunction in diabetic rats[J]. Dig Dis Sci, 2012,57(5):1197-1202.

[9] Ma J, Rayner CK, Jones KL, et al. Insulin secretion in healthy subjects and patients with Type 2 diabetes:role of the gastrointestinal tract[J]. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab, 2009,23(4):413-424.

[10]Barber AJ, Gardner TW, Abcouwer SF. The significance of vascular and neural apoptosis to the pathology of diabetic retinopathy[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2011,52(2):1156-1163.

[11]Hejazi RA, McCallum RW, Sarosiek I. Prokinetics in diabetic gastroparesis[J]. Curr Gastroenterol Rep, 2012,14(4):297-305.

[12]龍啟成，桂 春，朱立光，等. Neuregulin-1在糖尿病大鼠心肌組織中的表達變化[J].中國病理生理雜志, 2012，28(4)：1-5.

[13]Broglio F, Papotti M, Muccioli G, et al. Brain-gut communication: cortistatin, somatostatin and ghrelin. Trends Endocrinol Metab, 2007,18(6):246-251.

[14]Davenport AP, Bonner TI, Foord SM,et al. International Union of Pharmacology. LVI. Ghrelin receptor nomenclature, distribution, and function[J]. Pharmacol Rev, 2005,57(4):541-546.

[15]De Ambrogi M, Volpe S, Tamanini C. Ghrelin: central and peripheral effects of a novel peptydil hormone[J]. Med Sci Monit, 2003,9(9):RA217-RA224.

[16]Granado M, García-Cáceres C, Tuda M, et al. Insulin and growth hormone-releasing peptide-6 (GHRP-6) have differential beneficial effects on cell turnover in the pituitary, hypothalamus and cerebellum of streptozotocin (STZ)-induced diabetic rats[J]. Mol Cell Endocrinol, 2011,337(1-2):101-113.

[17]Gasco V, Beccuti G, Marotta F, et al. Endocrine and metabolic actions of ghrelin[J]. Endocr Dev, 2010,17:86-95.

[19]Ukkola O. Ghrelin in Type 2 diabetes mellitus and metabolic syndrome[J]. Mol Cell Endocrinol, 2011,340(1):26-28.

[20]Somogyi V, Gyorffy A, Scalise TJ, et al. Endocrine factors in the hypothalamic regulation of food intake in females: a review of the physiological roles and interactions of ghrelin, leptin, thyroid hormones, oestrogen and insulin. Nutr Res Rev, 2011,22:1-23.

Effectsofghrelinonfiringactivityofgastricdistension-sensitiveneuronsinhypothalamicarcuatusnucleusandgastricmotilityindiabeticrats

XU Luo, GUO Fei-fei, SUN Xiang-rong, GAO Sheng-li, GONG Yan-ling, QIU Bei-bei

(DepartmentofPathophysiology,QingdaoUniversityMedicalCollege,Qingdao266021,China.E-mail:xu.luo@163.com)

AIM: To study the roles of ghrelin in the regulation of gastric distension (GD)-sensitive neurons in the hypothalamic arcuate nucleus (Arc) and gastric motility in diabetes mellitus (DM) rats.METHODSDM rat model was made by intraperitoneal injection of streptozotocin. The effects of ghrelin and [D-Lys3]-GHRP-6 on GD-sensitive neurons in the Arc of DM rats were observed by recording the extracellular potentials of single neurons, and the gastric motility was also monitoredinvivo. The expression of ghrelin receptor,growth hormone secretagogue receptor (GHS-R), in Arc was studied by real-time PCR and immunofluorescene method.RESULTS(1) Ninety-eight GD-sensitivity neurons were recorded in the Arc of normal rats, in which 64.3% were classified as GD-excitatory (GD-E) neurons and 35.7% were GD-inhibitory (GD-I) neurons. Microinjection of ghrelin excited 73.0% of the 63 GD-E neurons and the discharge frequency significantly increased as compared with the neurons treated with saline. Ghrelin inhibited 60.0% of the 35 GD-I neurons and the discharge frequency was significantly reduced (P<0.01). The effect of ghrelin was blocked by the antagonist of ghrelin [D-Lys3]-GHRP-6. (2) Sixty-six GD-sensitive neurons were recorded in the Arc of diabetes rats, in which 64.3% were GD-E neurons, and 35.7% were GD-I neurons. Microinjection of ghrelin excited 35.1% of the GD-E neurons and the discharge frequency significantly increased as compared with the neurons treated with saline. Ghrelin inhibited 21 of the 29 GD-I neurons (72.4%) and the discharge frequency was significantly reduced. Compared with normal control group, the ratio of GD-E and GD-I neurons in diabetic rat Arc GD-sensitive neurons was not significantly changed. However, the ratio of GD-E neurons treated with ghrelin was significantly decreased, and the average increase rate of discharge frequency was significantly decreased. Ghrelin did not change GD-I neurons rejection ratio and discharge frequency average reduction rate. (3) Microinjection of ghrelin into the Arc significantly promoted gastric motility in normal and DM rats, and a significant dose-dependent manner was observed. However, the promotion effect of ghrelin on gastric motility in normal rats was stronger than that in DM rats, and the effect was completely blocked by [D-Lys3]-GHRP-6. (4) The mRNA expression of GHS-R1a in the hypothalamic Arc of diabetic rats significantly reduced as compared with the normal control rats. The protein level of GHS-R1a in the hypothalamic Arc was also significantly reduced in DM rats.CONCLUSIONGhrelin regulates the activity of GD-sensitive neurons in hippocampus Arc of diabetic rats by the action on ghrelin receptor.

Arcuatus nucleus; Diabetes mellitus; Ghrelin; Gastric distension-sensitive neurons; Gastric motility; Rats

R338.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2013.01.005

1000- 4718(2013)01- 0028- 08

2012- 07- 23

2012- 10- 25

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.30470642；No.30670780；No.31071014；No.81100260；No. 81270460)；山東省科技攻關(guān)項目(No.2008GG10002006)； 山東省衛(wèi)生廳項目(No.2007HZ026)；青島市科技局項目[No.11-2-3-3-(2)-nsh]

△通訊作者 Tel： 0532-82991713; E-mail: xu.luo@163.com