吉林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 黑龍江省四方山農(nóng)場(chǎng) 李 壯 郭明寶 郭南南

維生素C是最重要的水溶性抗氧化劑之一，可增強(qiáng)雞和豬的抗應(yīng)激能力，緩解小鼠心肌炎等（Pallauf等，2013；Halici等，2012；Jeong 等，2010）。研究表明，維生素C對(duì)哺乳動(dòng)物的保健功能主要是通過強(qiáng)抗氧化作用和抗炎作用來實(shí)現(xiàn) （El-Gendy等，2010）。而脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2（Lp-PLA2）是新近發(fā)現(xiàn)的炎癥標(biāo)志物（Rosenson和Stafforini，2012）。因此，本試驗(yàn)研究了維生素C對(duì)Lp-PLA2表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 THP-1細(xì)胞，由本實(shí)驗(yàn)室保存；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，均購自杭州博日生物科技有限公司；Trizol A+，購自天根生化有限公司；維生素C、PMA，均購自sigma公司；LPS、PD98059，均購自碧云天生物科技有限公司；1640細(xì)胞培養(yǎng)液，購自Hyclone公司；FBS、非必需氨基酸、青鏈霉素，均購自PAA公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) Raw264.7細(xì)胞復(fù)蘇于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。試驗(yàn)前，將含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液換成含0.5%FBS的DMEM培養(yǎng)液對(duì)其同步化 16 h，之后使用 LPS（1 μg/mL）對(duì)同步化的細(xì)胞進(jìn)行處理，1 h后，選取不同維生素C濃度（10、50、100 μg/mL）和不同孵育時(shí)間（4、8、12、24 h）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行孵育，對(duì)照組同步化后不進(jìn)行任何處理。

1.2.2 實(shí)時(shí)定量PCR 將經(jīng)過孵育的Raw264.7細(xì)胞棄去培養(yǎng)液，用PBS清洗2次，然后使用Trizol A+試劑進(jìn)行總RNA提取，獲得總RNA后，分別取1μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后用獲得的cDNA為模板，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。Lp-PLA2熒光定量PCR引物：5'-GAGGCTGTATGCTCAACCCA-3'；5'-CACCAGAGCGAGTCAGATCC-3'。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Prism 5進(jìn)行制圖，并采用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度維生素C對(duì)Lp-PLA2表達(dá)的影響先使用1 μg/mL LPS處理同步化的細(xì)胞1 h，之后使用不同濃度的維生素 C （10、50、100 μg/mL）孵育經(jīng)LPS處理過的Raw264.7細(xì)胞，孵育12 h后，采用實(shí)時(shí)定量PCR方法對(duì)Lp-PLA2的mRNA水平進(jìn)行檢測(cè)。由圖1可見，與對(duì)照相比，LPS能夠顯著上調(diào)Lp-PLA2的mRNA水平，并且在LPS存在的條件下，Lp-PLA2的表達(dá)隨維生素C濃度的升高而逐漸下降（圖1）。

圖1 不同濃度維生素C對(duì)Lp-PLA2表達(dá)的影響（n=3）

2.2 不同維生素C處理時(shí)間對(duì)Lp-PLA2表達(dá)的影響 將同步化及LPS處理后的Raw264.7細(xì)胞采用 50 μg/mL 的維生素 C 分別孵育 4、8、12、24 h，采用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)Lp-PLA2的mRNA水平，結(jié)果見圖2。由圖2可見，隨著處理時(shí)間的延長，維生素C能夠顯著抑制由LPS誘導(dǎo)的Lp-PLA2的mRNA水平的上升，但是在24 h時(shí)LP-PLA2 mRNA水平恢復(fù)至原來水平。

圖2 維生素C不同處理時(shí)間對(duì)Lp-PLA2表達(dá)的影響（n=3）

2.3 維生素C通過NFκB調(diào)節(jié)Lp-PLA2的表達(dá)采用1 μg/mL LPS處理同步化的Raw264.7細(xì)胞，1 h后，分別加入維生素C和NFκB的抑制劑（PDTC）孵育12 h，結(jié)果見圖3。由圖3可見，抑制NFκB能夠降低Lp-PLA2的表達(dá)水平。

圖3 維生素C通過NFκB對(duì)Lp-PLA2表達(dá)調(diào)節(jié)（n=3）

3 結(jié)論

維生素C是哺乳動(dòng)物正常生長發(fā)育和維持生理功能必不可少的營養(yǎng)物質(zhì)，可通過強(qiáng)抗氧化功能和抗炎功能促進(jìn)動(dòng)物的生長，提高免疫力，抵抗應(yīng)激反應(yīng)等。Lp-PLA2是新近發(fā)現(xiàn)的炎癥標(biāo)志物，大量研究表明，當(dāng)該酶在血漿中的含量升高時(shí)，體內(nèi)的炎癥增加，反之下降。因此，本試驗(yàn)提出維生素C能夠降低Lp-PLA2表達(dá)的假設(shè)，并進(jìn)行了初步驗(yàn)證。結(jié)果顯示，Lp-PLA2的mRNA水平隨著維生素C濃度的增加逐漸降低；在50 μg/mL維生素C濃度下，隨著孵育時(shí)間的延長，Lp-PLA2 mRNA水平也逐步下降，但在24 h后回升；并且抑制NFκB信號(hào)通路能夠顯著抑制Lp-PLA2的mRNA水平，因此推測(cè)維生素C可能通過抑制NFκB抑制Lp-PLA2的轉(zhuǎn)錄。

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